楊龍豐，楊秀清

（1.大同市林業(yè)建設(shè)工程質(zhì)量監(jiān)督站，山西大同 037038；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)系，山西太谷 030801）

水楊酸對(duì)華北落葉松高溫脅迫緩解的研究

楊龍豐1，楊秀清2

（1.大同市林業(yè)建設(shè)工程質(zhì)量監(jiān)督站，山西大同 037038；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)系，山西太谷 030801）

以當(dāng)年華北落葉松種子為實(shí)驗(yàn)材料，研究3種不同濃度水楊酸（SA）對(duì)華北落葉松幼苗體內(nèi)SOD酶活性的影響。結(jié)果表明：用0.3mmol/L SA處理華北落葉松幼苗后，可提高其體內(nèi)SOD酶活性,即可顯著提高華北落葉松幼苗的抗熱性，從而使華北落葉松幼苗在低海拔地區(qū)能安全度過酷熱的夏季。

華北落葉松種子；水楊酸；SOD酶活性

全球環(huán)境日益惡化，溫室效應(yīng)加劇，增加森林覆蓋率是解決這些問題的最有效途徑，而提高造林成活率是造林成功中最關(guān)鍵的因素。在華北地區(qū)，華北落葉松是山地造林首選樹種，在實(shí)踐中，華北落葉松由于抗熱性差，在低海拔地區(qū)難以度過酷熱的夏季。本次實(shí)驗(yàn)旨在通過分析3個(gè)不同濃度SA對(duì)華北落葉松幼苗體內(nèi)SOD酶活性的影響，確定最佳的SA濃度，用以外施提高華北落葉松幼苗的抗熱性。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性的大小。在有可氧化物的存在下，核黃素可被還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易氧化而產(chǎn)生O2-，O2-可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)甲，藍(lán)甲在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O2-從而抑制了藍(lán)甲的形成。光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

當(dāng)年華北落葉松種子。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）選種處理。從純凈的種子中隨機(jī)抽取3200粒種子，先用清水沖洗，再用0.001mol/L的高錳酸鉀浸泡30min。而后用蒸餾水沖洗1遍，于始溫45℃的水中浸泡3d。

（2）擺放種子。發(fā)芽皿墊上濾紙，用紗布作為導(dǎo)水器，燒杯中加蒸餾水，即發(fā)芽床。將經(jīng)過消毒浸種的種子分組放置于32個(gè)發(fā)芽床，每個(gè)發(fā)芽床上整齊的放置100粒種子，種粒之間保持一定距離，以免霉菌蔓延感染和幼根相互接觸。種粒的排列應(yīng)有一定的順序。在每一發(fā)芽床上貼上標(biāo)簽，寫明送檢樣品號(hào)，重復(fù)號(hào)、置床日期，以免錯(cuò)亂，然后將發(fā)芽器放入光照發(fā)芽箱。

（3）常溫發(fā)芽。把培養(yǎng)皿放于SPX-G型的光照培養(yǎng)箱中，在（23±0.5）℃的全光照下培養(yǎng)14d。在此期間要每天觀察發(fā)芽情況并保持濾紙濕潤(rùn)。

（4）水楊酸處理。于第15天將華北落葉松幼苗分別移到新的培養(yǎng)皿中，其中24個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入0.1、0.3、0.5mmol/L的SA（水楊酸），每個(gè)濃度8個(gè)培養(yǎng)皿，記作處理2、3、4，另外8個(gè)培養(yǎng)皿中加蒸餾水，作為對(duì)照，記作處理1。將放入幼苗的培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)柜中分別培養(yǎng)1～8h，溫度（23±0.5）℃，光照為全光照。分別記錄各處理的華北落葉松幼苗在1～8h的各個(gè)時(shí)間段的SOD活性，編號(hào)為 1-1、2-1、3-1、4-1、1-2，……4-8，前邊的數(shù)字 1、2、3、4 為處理 1、2、3、4，后邊的 1～8代表培養(yǎng)時(shí)間。

（5）高溫處理。再次制作新的培養(yǎng)器，將SA處理過的華北落葉松幼苗再種到新的苗床上，種前用蒸餾水將苗體洗一下，然后放入培養(yǎng)箱，溫度調(diào)到（45±0.5）℃，全光照，處理 2h，這期間保持濾紙濕潤(rùn)。

2 測(cè)定方法

2.1 NBT（氮藍(lán)四唑）反應(yīng)液配制

（1）配制50mMpH7.8的磷酸緩沖液240mL和 50mL （ 甲 液 ： 乙 液 =9∶1）。 甲 液 ∶取Na2HPO4.12H2O 5.370g定容于300mL；乙液：取KH2PO40.34g定容于50mL。

（2）13mM甲硫氨酸。在240mL50mM的磷酸緩沖液中加入0.464g甲硫氨酸，待完全溶解后加入后面的試劑。

（3）63uM氮藍(lán)四唑（NBT）。在30mL溶液（2）中加入0.0112gNBT。

（4）1.3mM核黃素。在溶液 （3） 中加入0.014mg 核黃素；（0.014g/30ml，取 100ul）。

（5）0.1mM核黃素。在溶液 （4） 中加入0.0088gEDTA。

將上述步驟配制的反應(yīng)液避光保存。

2.2 酶液提取

剪取0.1g植物材料，置于研缽中，加入少許石英砂和1mLpH7.8磷酸緩沖液，分2次加入，在冰上研磨成勻漿；做3份重復(fù)，分別轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，12000rpm冷凍離心15min，取上清液供酶活測(cè)定。

2.3 照光實(shí)驗(yàn)

取34支大試管，各加入6ml反應(yīng)液，從32份酶液中各取50uL分別加入32支中，搖勻。另外2支為對(duì)照，1支對(duì)照管保存于暗處，作為參比；另1支對(duì)照管和32支樣管在25℃下照光約20min后，在560nm波長(zhǎng)下比色。

3 結(jié)果計(jì)算

以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活單位。

Ack—照光對(duì)照管的吸光值，Ae—樣品管的吸光值，V—酶提取液總體積，Vt—測(cè)定時(shí)所用的酶液體積，W—樣品鮮重。樣品酶活性單位表示：SOD酶活性單位μmol·g-1（Fw）·min-1。

4 結(jié)果與分析

4.1 對(duì)照的華北落葉松幼苗SOD酶活性變化的分析

對(duì)照的華北落葉松幼苗，SOD酶活性的變化總體呈現(xiàn)出小幅波動(dòng)，前1～6h變化不明顯，6～7h開始呈現(xiàn)出大幅下降趨勢(shì)，第8小時(shí)時(shí)下降到最低點(diǎn)。

表1 在4種不同處理下華北落葉松幼苗SOD的活性變化

4.2 0.1mmol/L SA處理的華北落葉松幼苗SOD酶活性變化分析

用0.1mmol/L SA處理的華北落葉松幼苗，SOD酶活性的變化呈現(xiàn)出不斷大幅波動(dòng)的趨勢(shì)。1～2h時(shí)無明顯變化，2～3h迅速上升，3～4h迅速下降，4～5h再次迅速升高，5～7h又迅速下降，第8小時(shí)又大幅上升。曲線有3個(gè)高峰2個(gè)低谷，3～5h這個(gè)時(shí)間段SOD酶活性高于對(duì)照，且第3小時(shí)最高，說明第3小時(shí)為此濃度的最佳處理時(shí)間。

4.3 0.3mmol/L SA溶液處理的華北落葉松幼苗SOD酶活性變化分析

用0.3mmol/L SA溶液處理的華北落葉松幼苗，SOD酶活性的變化大致與0.1mmol/L SA溶液處理的華北落葉松幼苗SOD酶活性的變化相同，只是在1～2h時(shí)有明顯的上升，其余變化趨勢(shì)一致。曲線有3個(gè)高峰2個(gè)低谷，2～5h這個(gè)時(shí)間段SOD酶活性高于對(duì)照，且第5小時(shí)最高，說明第5小時(shí)為此濃度的最佳處理時(shí)間。

4.4 0.5mmol/L SA溶液處理的華北落葉松幼苗SOD酶活性變化分析

用0.5mmol/L SA溶液處理的華北落葉松幼苗，SOD酶活性的變化大致與0.1mmol/LSA溶液處理的華北落葉松幼苗SOD酶活性的變化相同，只是在1～2h時(shí)大幅度上升，2～3h時(shí)下降，其余變化趨勢(shì)一致。曲線有3個(gè)高峰2個(gè)低谷，第2、3、5、6時(shí)SOD酶活性高于對(duì)照，5最高，說明第5小時(shí)為此濃度的最佳處理時(shí)間。

4.5 綜合分析

SA處理過的SOD活性變化曲線的共同點(diǎn)是上升與下降趨勢(shì)大致相同，與對(duì)照相比表現(xiàn)出明顯的大起大落，而對(duì)照曲線變化則很平緩；前2h 4條曲線變化基本一致，但5～6h時(shí)SA處理過的SOD酶活性變化與對(duì)照變化趨勢(shì)相反；5～6h時(shí)對(duì)照的SOD酶活性升高，而SA處理過的SOD酶活性反而迅速降低；7～8h時(shí)對(duì)照的SOD酶活性下降并降到最低，而SA處理過的SOD酶活性反而迅速升高，此現(xiàn)象表明長(zhǎng)時(shí)間的SA處理會(huì)使華北落葉松體內(nèi)的生理反應(yīng)發(fā)生紊亂。從圖1可以看出不同濃度的SA處理2～3h華北落葉松幼苗后，均可提高華北落葉松高溫處理后SOD酶的活性，即均可提高華北落葉松的抗熱性，此結(jié)果與玉米種子經(jīng)SA預(yù)處理后其幼苗抗熱性提高的研究一致。

5 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果是外施0.3mmol/L SA可顯著提高華北落葉松的抗熱性，此與以0.3mmol/L SA預(yù)處理的玉米幼苗耐熱性效果最好的結(jié)論一致。本次實(shí)驗(yàn)找到的最佳處理時(shí)間是5h。

SA對(duì)植物抗性的作用已有很多研究，被認(rèn)為是對(duì)逆境脅迫反應(yīng)的胞內(nèi)信號(hào)分子。SA能減緩高溫脅迫所引起的脅變反應(yīng)，本次試驗(yàn)得出結(jié)論：SA可提高植物抗熱性。其結(jié)果為華北落葉松的低海拔引種栽培提供了理論依據(jù)。

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Q745.78

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1002-3356（2011）06-0001-03

2011-09-05