艾坤，武丹，常小榮，劉密，劉梨，劉美榮

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種免疫介導(dǎo)的慢性、炎癥性和破壞性疾病，是一類嚴(yán)重危害人類身體健康的常見自身免疫性疾病。針刺療法已被確認(rèn)對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有較好的療效。本研究通過類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型(佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠)觀察相同的電針刺激分別作用于足三里、關(guān)元、委中單個(gè)腧穴所引起的治療前后大鼠足跖關(guān)節(jié)腫脹度的變化，以白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-2、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α為代表的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子在血漿中含量變化，探討針刺實(shí)驗(yàn)穴位的免疫調(diào)整作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康成年Wistar大鼠60只，雄性，體重180～200 g，清潔級，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物證號SYXKC(湘)2003-0001。隨機(jī)分為5組：空白組、模型組、足三里組、關(guān)元組、委中組，每組12只。實(shí)驗(yàn)過程中有3只大鼠死亡，其中足三里組1只，關(guān)元組1只，空白組1只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 液體石蠟、羊毛脂、卡介苗凍干粉(50 mg/支)：北京生物制品研究所；IL-1、IL-2、IL-10、TNF-α放免試劑盒：北京華英生物技術(shù)研究所。

1.3 方法

1.3.1 造模 選用Freund氏完全佐劑(FCA)造模法[1]。FCA制備方法：取液體卡介苗2支(160 mg)，80℃滅活1 h，均勻混入高壓滅菌(121℃、1.1 kg/cm2、30 min)的液體石蠟、羊毛脂(2∶1)16 ml，使混合液的含菌濃度達(dá)到10 mg/ml。超聲波細(xì)胞粉碎儀乳化20 min。除空白組以外，每只大鼠右足墊皮內(nèi)注射0.1 ml致敏大鼠。

1.3.2 穴位定位與針刺方法 實(shí)驗(yàn)組分別選擇足三里、關(guān)元，針刺對照組選擇委中。取穴定位參照“十五”國家規(guī)劃統(tǒng)編教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位及擬人對照法定位。所有穴位均用直刺。大鼠清醒固定，各穴均用30號1寸針進(jìn)針后，接華佗電針儀，疏密波，疏波頻率20 Hz，密波頻率100 Hz，強(qiáng)度以針柄輕微抖動為度。每次留針20 min。于造模后第3天開始針刺，隔日1次，共16次。

1.3.3 標(biāo)本采集 大鼠腹腔注射20%烏拉坦1 ml/100 g，麻醉后斷頭采血，2 ml注入含10%EDTA-Na230 μl和40000 U/ml抑肽酶40 μl的5 ml試管中，上下緩慢顛倒3次混勻，其余3～4 ml注入干燥試管；4℃ ，3000 r/min離心10 min；取上清液放入小試管中，-20℃冰凍保存。

1.3.4 指標(biāo)檢測 大鼠足跖關(guān)節(jié)腫脹度采用測量大鼠非致炎跖圍的方法；IL-1、IL-2、IL-10、TNF-α均采用放射免疫法測定，由北京華英生物技術(shù)研究所測定。

2 結(jié)果

2.1 大鼠足跖關(guān)節(jié)腫脹度 造模后，大鼠足跖關(guān)節(jié)明顯腫脹，模型組與空白組比較具有顯著性差異(P＜0.05)。足三里組、關(guān)元組、委中組治療前后大鼠跖圍比較均具有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠跖圍變化(cm)

2.2 血漿IL-1、IL-2、IL-10、TNF-α含量 模型組血漿IL-1、IL-2、TNF-α含量較空白組明顯升高(P＜0.01)，血漿IL-10含量較空白組明顯降低(P＜0.01)。足三里組、關(guān)元組血漿IL-1、IL-2、TNF-α含量較模型組明顯降低(P＜0.01)，血漿IL-10含量較模型組明顯升高(P＜0.01)；足三里和關(guān)元兩組間 IL-1、IL-2、TNF-α、IL-10含量無顯著性差異(均P＞0.05)。委中組血漿IL-1、IL-2、TNF-α含量較模型組有降低(P＜0.05)，血漿IL-10含量較模型組升高(P＜0.05)；委中組血漿IL-1、IL-2、TNF-α、IL-10含量與足三里組、關(guān)元組比較均有非常顯著性差異(P＜0.01)。見表2。

2.3 相關(guān)性分析 大鼠足跖腫脹度與IL-1、IL-2、TNF-α 呈 正 相 關(guān) (r=0.881,r=0.912,r=0.907,P＜0.01)；IL-1、IL-2、TNF-α之間呈正相關(guān)(P＜0.01)；IL-10與大鼠足跖腫脹度、IL-1、IL-2、TNF-α呈負(fù)相關(guān)(r=-0.436,P＜0.01;r=-0.365,P＜0.01;r=-0.519,P＜0.01;r=-0.293,P＜0.05)。

表2 各組大鼠血漿中IL-1、IL-2、IL-10、TNF-α含量(ng/L)

3 討論

佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要表現(xiàn)，主要侵犯關(guān)節(jié)及其周圍組織的自身免疫性疾病，是目前研究針灸免疫調(diào)節(jié)機(jī)制較為理想的動物模型。其原發(fā)病變主要表現(xiàn)為致炎局部的炎癥反應(yīng)，續(xù)發(fā)病變表現(xiàn)為非致炎足爪腫脹[2-3]。

IL-1具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，并有致熱和介導(dǎo)炎癥的作用。IL-2是一種免疫增強(qiáng)劑，主要由T細(xì)胞產(chǎn)生。TNF-α是重要的致炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子。IL-l、IL-2、TNF-α既是炎癥因子，又參與機(jī)體的免疫反應(yīng)。IL-2和TNF-α是免疫促進(jìn)因子，能促進(jìn)機(jī)體的免疫反應(yīng)。AA大鼠外周單核細(xì)胞和滑膜的巨噬細(xì)胞分泌IL-l、IL-2、TNF-α，使外周血和關(guān)節(jié)滑膜液中IL-l、IL-2、TNF-α明顯升高。因此，本實(shí)驗(yàn)中，AA大鼠血清IL-1、IL-2、TNF-α明顯高于空白組；IL-1、IL-2、TNF-α之間呈正相關(guān)，且與大鼠關(guān)節(jié)腫脹度(跖圍)呈正相關(guān)，說明在AA發(fā)病中，IL-1、IL-2、TNF-α起著同樣的作用，都是炎癥因子。

針灸治療AA大鼠，主要是降低血清中IL-1、IL-2、TNF-α的含量，從而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。李熳電針AA大鼠，發(fā)現(xiàn)能抑制皮膚組織IL-1Ra mRNA的表達(dá)[4]。唐照亮觀察艾灸AA大鼠，能減少血清中IL-1的含量[5]。李世光等研究針灸對RA的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)通過IL-2受體百分率下降，IL-2、TNF-α的含量明顯改變，使患者的免疫功能得以改善[6]。唐照亮等觀察AA大鼠失去腎上腺和海馬交感神經(jīng)的支配，IL-6、IL-2含量上升，艾灸能減輕AA大鼠炎癥腫脹，恢復(fù)和促進(jìn)大鼠松果腺褪黑素(MT)的分泌，使IL-6、IL-2降低[7]。唐照亮等進(jìn)一步觀察到，艾灸能恢復(fù)和促進(jìn)刀豆素A(ConA)誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，降低IL-1的含量[8]。本實(shí)驗(yàn)顯示，針灸足三里穴、關(guān)元穴后能有效降低AA大鼠血漿IL-1、IL-2、TNF-α水平，且大鼠足跖關(guān)節(jié)腫脹度(趾圍)明顯降低，相互之間呈正相關(guān)。

IL-10有很強(qiáng)的抗炎作用，能明顯抑制單核-吞噬細(xì)胞的致炎作用，可能是一種有效的抗炎物質(zhì)[9-10]。IL-10不僅是誘導(dǎo)外周耐受的一種細(xì)胞因子，而且還是一個(gè)具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，可抑制中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥因子和趨化因子，并通過抑制單核細(xì)胞MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子的表達(dá)，抑制其抗原遞呈作用。張紅星等發(fā)現(xiàn)，頭針可在一定范圍內(nèi)增強(qiáng)IL-10表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)，減輕腦缺血再灌注損傷[11]。研究還發(fā)現(xiàn)，針刺能提高正常大鼠IL-10/IL-6比值，升高創(chuàng)傷痛應(yīng)激所致的免疫抑制患者IL-10/IL-6比值[12]。

有報(bào)道急性期RA患者血清中IL-10水平顯著升高，由滑膜液中的單個(gè)核細(xì)胞自發(fā)分泌IL-10。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在AA造模后，血清中IL-10水平有所升高，但至中后期則低于正常大鼠。通過電針足三里、關(guān)元后，IL-10水平顯著升高，同時(shí)可見AA大鼠足跖腫脹減輕。高水平的IL-10可能是針灸發(fā)揮免疫抑制作用的重要因素。

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)血漿炎性因子含量以針刺足三里和關(guān)元作用最強(qiáng)，說明電針調(diào)節(jié)免疫具有腧穴特異性。

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