王 兵，王勇強(qiáng)，邵 蕾，曹書華

(天津市第一中心醫(yī)院，天津300192)

近年研究表明，細(xì)菌脂多糖(LPS)通過Toll樣受體4(TLR4)觸發(fā)宿主自身免疫，激活血小板使其大量破壞，是膿毒癥相關(guān)血小板減少的主要原因［1，2］。2008 年10月 ～2009年1月，為探討加味涼膈散對(duì)LPS誘發(fā)小鼠血小板減少癥的影響及其機(jī)制，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 健康雄性清潔級(jí)小鼠，8～10周齡，體質(zhì)量(25±2)g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大腸桿菌LPS(Sigma)，ELISA試劑盒(ADL)，酶標(biāo)儀(奧地利)，血細(xì)胞分析儀(日本)。加味涼膈散顆粒由江陰天江藥業(yè)公司提供，由連翹、梔子、黃芩、淡竹葉、芒硝、玄參、丹參、麥冬、西洋參、大黃、薄荷、甘草組成。

1．2 方法

1．2．1 模型制備 將176只小鼠隨機(jī)分為8組，對(duì)照組8只用生理鹽水(NS)0．2 ml/(10 g·d)灌胃3 d后，經(jīng)尾靜脈注射NS 100 μl/10 g，繼用NS灌胃3 d。模型組24只用NS灌胃3 d后，參照文獻(xiàn)［3］方法經(jīng)尾靜脈注射LPS 8 mg/kg，制備內(nèi)毒素血癥模型，繼用NS灌胃3 d。低劑量、中劑量、高劑量防治組各24 只，分別以加味涼膈散 0．94、1．89、2．84 g/ml灌胃3 d，然后經(jīng)尾靜脈注射LPS 8 mg/kg，再用相應(yīng)劑量加味涼膈散灌胃3 d。低劑量、中劑量、高劑量治療組各24只，分別于尾靜脈注射LPS 8 mg/kg，然后用相應(yīng)劑量加味涼膈散灌胃3 d。除對(duì)照組外，其余各組于尾靜脈注射LPS后分別分為6、48、72 h三組。

1．2．2 標(biāo)本采集及觀察指標(biāo)檢測 摘除各組眼球取血1 ml，采用血細(xì)胞分析儀檢測其血小板計(jì)數(shù)(PCL);ELISA法檢測血漿巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和可溶性CD40配體(sCD40L);流式細(xì)胞儀檢測血小板TLR4表達(dá)。

1．2．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，組間比較用單因素方差分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組不同時(shí)間的PCL變化 見表1。

2．2 各組不同時(shí)間的血漿sCD40L變化 見表2。

2．3 各組不同時(shí)間的血漿M-CSF變化 見表3。

2．4 各組不同時(shí)間的血小板TLR4表達(dá)變化 見表4。

3 討論

感染誘發(fā)的血小板減少癥是膿毒癥患者死亡的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素［3］，Toll樣受體作為識(shí)別細(xì)菌共有成分的“模式”識(shí)別受體，主要在識(shí)別細(xì)菌后誘導(dǎo)免疫細(xì)胞內(nèi)炎癥介質(zhì)過度生成，是引發(fā)膿毒癥的關(guān)鍵因素［4］。在膿毒癥中，血小板是聯(lián)系凝血和炎性反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)，其表面有多種黏附分子和受體表達(dá)。前期研究表明，血小板可表達(dá)功能性TLR4，LPS可通過血小板表面TLR4誘導(dǎo)血小板活化，引起血小板減少［2，5］。Cognasse 等發(fā)現(xiàn)，LPS 對(duì)血小板免疫調(diào)節(jié)因子釋放的調(diào)控效力是血小板TLR4介導(dǎo)的。循環(huán)中95%以上的sCD40L來源于血小板，是體內(nèi)血小板活化的血漿標(biāo)記物。Francois等［6］研究證實(shí)，膿毒癥患者不明原因的血小板減少癥與吞噬血細(xì)胞作用和M-CSF升高有關(guān)。

表1 各組不同時(shí)間的PCL變化(×109/L，±s)

表1 各組不同時(shí)間的PCL變化(×109/L，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0．05;與模型組比較，#P＜0．05;與低劑量治療組比較，△P＜0．05;與中劑量治療組比較，☆P＜0．05;與高劑量治療組比較，▲P ＜0．05;與低劑量防治組比較，★P ＜0．05

組別 n 6 h 48 h 72 h對(duì)照組8 1 013．10 ±136．60模型組 24 298．30 ± 79．80* 654．40 ±106．50* 771．50 ±129．30*低劑量治療組 24 439．28 ± 88．30*# 722．31 ± 88．22* 911．35 ±111．67#中劑量治療組 24 397．76 ±101．61*# 757．05 ± 93．67* 952．13 ±104．02#高劑量治療組 24 357．98± 79．47* 576．66± 86．85＊△☆ 879．16±106．75*低劑量防治組 24 629．59±105．62*#△☆▲ 873．78±112．57*#△☆▲ 964．40± 97．01#中劑量防治組 24 747．32± 96．16*#△☆▲★ 822．98± 99．16*#▲ 942．75±101．04#高劑量防治組 24 691．31±103．65*#☆▲ 731．35± 77．34＊▲★ 989．42±124．17#

表2 各組不同時(shí)間的血漿sCD40L變化(ng/ml，±s)

表2 各組不同時(shí)間的血漿sCD40L變化(ng/ml，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0．05;與模型組比較，#P＜0．05;與低劑量治療組比較，△P＜0．05;與中劑量治療組比較，☆P＜0．05;與高劑量治療組比較，▲P ＜0．05;與低劑量防治組比較，★P ＜0．05

?

表3 各組不同時(shí)間的血漿M-CSF變化(pg/ml，±s)

表3 各組不同時(shí)間的血漿M-CSF變化(pg/ml，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0．05;與模型組比較，#P＜0．05;與低劑量治療組比較，△P＜0．05;與中劑量治療組比較，☆P＜0．05;與高劑量治療組比較，▲P ＜0．05;與低劑量防治組比較，★P ＜0．05

組別 n 6 h 48 h 72 h對(duì)照組8 179．35 ±15．74模型組 24 394．62 ±27．53* 337．78 ±31．02* 289．63 ±23．66*低劑量治療組 24 340．50 ±34．51*# 293．13 ±29．47*# 288．52 ±21．74*中劑量治療組 24 320．55 ±26．28*# 296．93 ±26．65*# 262．91 ±23．68*#高劑量治療組 24 363．21±35．27*#☆ 303．69±24．49*# 280．17±29．71*低劑量防治組 24 298．83±34．50*#△▲ 291．92±24．71*# 252．41±36．10*#△▲中劑量防治組 24 265．22±22．07*#△☆▲★ 279．33±28．92*# 265．33±27．68*高劑量防治組 24 268．97±27．74*#△☆▲★ 245．15±25．18*#△☆▲★ 239．93±23．56*#△▲

表4 各組不同時(shí)間的血小板TLR4表達(dá)變化(%，±s)

表4 各組不同時(shí)間的血小板TLR4表達(dá)變化(%，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0．05;與模型組比較，#P＜0．05;與高劑量治療組比較，▲P ＜0．05

組別 n 6 h 48 h 72 h對(duì)照組8 45．76 ±2．40模型組 24 50．37 ±3．20* 48．98 ±1．77* 46．71 ±2．74低劑量治療組 24 48．84 ±2．79* 48．37 ±2．59 47．06 ±2．70中劑量治療組 24 47．81 ±2．68 47．37 ±2．75 46．82 ±2．34高劑量治療組 24 49．66 ±3．51* 49．95 ±2．87* 46．29 ±2．97低劑量防治組 24 47．91 ±2．53 46．93 ±2．63▲ 45．75 ±2．49中劑量防治組 24 47．74 ±3．03 47．36 ±2．81▲ 46．14 ±2．88高劑量防治組 24 46．85 ±2．42#▲ 46．48 ±2．74▲45．38 ±2．02

本研究顯示，小鼠尾靜脈注射 LPS后6 h其PCL下降近70%，血小板TLR4表達(dá)明顯增加，血漿M-CSF、sCD40L明顯升高;提示內(nèi)毒素血癥時(shí)血小板表達(dá)TLR4上調(diào)，并隨著以M-CSF升高為特征的巨噬細(xì)胞過度活化及以sCD40L升高為特征的血小板活化，使血漿M-CSF升高;一方面上調(diào)血小板表達(dá)TLR4，增強(qiáng)其識(shí)別并結(jié)合其配體LPS的能力，可增進(jìn)血小板活化、釋放及參與炎癥反應(yīng)的功能;另一方面M-CSF升高伴發(fā)的吞噬血細(xì)胞作用可使血小板壽命縮短，兩種過程都可增加血小板的消耗，使循環(huán)中的PCL進(jìn)一步減少。

內(nèi)毒素血癥動(dòng)物模型的病機(jī)特點(diǎn)是毒邪內(nèi)蘊(yùn)、絡(luò)脈瘀滯、正氣頻衰，毒、熱、瘀在其發(fā)病過程中相互搏結(jié)。本研究以解毒清熱名方?jīng)鲭跎?載宋《和劑局方》)為基本方加味，方中連翹清熱解毒、透散上焦之熱;配黃芩以清胸膈郁熱，梔子通瀉三焦、引火下行，大黃、芒硝瀉火通便，蕩滌中焦燥熱內(nèi)結(jié);薄荷、竹葉輕清疏散，解熱于上。根據(jù)“先證而治，截?cái)嗖荨钡闹蝿t，加用玄參、丹參以涼血滋陰、化瘀解毒;并在此基礎(chǔ)上加用西洋參補(bǔ)肺降火、生津液，以防熱盛而傷氣陰。全方清上與瀉下并行(瀉下為清瀉胸膈郁熱而設(shè))，體現(xiàn)“以瀉代清”和給邪以出路，同時(shí)兼顧熱盛傷正，體現(xiàn)祛邪而不忘扶正，全方以攻逐毒邪為主，兼顧化瘀通絡(luò)扶正。

本研究顯示，與模型組比較，加味涼膈散防治組PCL升高，M-CSF、sCD40L、TLR4 降低;且隨劑量增加，其作用增強(qiáng)。表明加味涼膈散可能通過拮抗LPS與血小板TLR4結(jié)合，抑制血小板TLR4表達(dá)上調(diào)，減少血小板及巨噬細(xì)胞過度活化，從而緩解LSP誘發(fā)的M-CSF減少。

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