楊 巍，張建軍，白維君

(遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽(yáng)110042)

胃癌是臨床常見(jiàn)腫瘤，中晚期胃癌患者病死率很高。新輔助化療治療中晚期胃癌雖取得一定療效，但少數(shù)患者治療后病情沒(méi)有緩解反而進(jìn)展，失去對(duì)局部病灶的控制，延誤手術(shù)、放療時(shí)機(jī)。因此，尋找簡(jiǎn)單易行、靈敏度高、特異性強(qiáng)的篩查胃癌化療療效的方法非常必要。凋亡抑制蛋白(IAP)家族是近年發(fā)現(xiàn)的具有強(qiáng)烈凋亡抑制作用的蛋白質(zhì)家族，X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(XIAP)是其家族新成員，可通過(guò)抑制 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 而阻斷胃癌細(xì)胞凋亡過(guò)程。為探討胃癌患者XIAP、XIAP mRNA表達(dá)與新輔助化療療效的關(guān)系，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇2006～2008年在我院行新輔助化療的胃癌患者30例，男19例、女11例，年齡41～68歲、，病程1～3個(gè)月，均經(jīng)手術(shù)及病理檢查確診。其中胃腺癌27例(高分化6例、中分化9例、低分化12例)，印戒細(xì)胞癌3例;病理分期均為Ⅲ期。根據(jù)其臨床療效及胃組織病理檢查分為有效組14例、無(wú)效組16例，并設(shè)10例胃炎患者的正常胃組織標(biāo)本作對(duì)照。

1．2 治療方法 患者均采用FOLFOX7化療方案，即奧沙利鉑130 mg/m2靜滴2 h、第1天，亞葉酸鈣400 mg/m2靜滴、第1天，5-氟尿嘧啶2 400 mg/m2持續(xù)靜滴46 h，每2周為一周期;連續(xù)治療2個(gè)周期。

1．3 檢測(cè)方法

1．3．1 RT-PCR法檢測(cè)XIAP mRNA表達(dá) 取兩組活檢標(biāo)本，根據(jù)試劑盒操作步驟、RT-PCR法檢測(cè)XIAP mRNA表達(dá)。RNA抽取、逆轉(zhuǎn)錄cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體積為25 ml，內(nèi)含10×buffer 2．5 ml、Mg2+1．5 ml、dNTP 0．5 ml、cDNA 2．0 ml、Taq 酶1．5 U，引物1、2 各1 ml，用 dd·H2O 補(bǔ)足體系至25 ml。反應(yīng)條件:94℃ 2 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃2 h。以基因引物行 PCR擴(kuò)增，β-actin為內(nèi)對(duì)照，XIAP基因引物序列(略)。XIAP產(chǎn)物335 bp，退火溫度57℃，循環(huán)次數(shù)35次;β-actin產(chǎn)物159 bp，退火溫度57℃，循環(huán)次數(shù)35次。對(duì)PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)激光密度掃描儀采集數(shù)據(jù)，以各基因與β-actin條帶的光密度比值作為分析指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1．3．2 Western-blot技術(shù)檢測(cè)XIAP表達(dá) 對(duì)組織蛋白提取后，分別行蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將凝膠蛋白質(zhì)marker部分用0．5%氨基黑10B染色，觀察蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移是否完全。最后進(jìn)行抗體雜交，在自動(dòng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)下成像，以Fluor Chen V2．0系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)。以電泳條帶的密度值作為條帶強(qiáng)度指標(biāo)，β-actin蛋白表達(dá)條帶強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)，用條帶密度值與相應(yīng)的β-actin密度值比值作指標(biāo)進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，各組胃組織XIAP mRNA、XIAP表達(dá)比較用方差分析，兩兩比較用SNKq檢驗(yàn)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組胃組織XIAP mRNA、XIAP表達(dá)比較見(jiàn)表1。

表1 各組胃組織XIAP mRNA、XIAP表達(dá)比較(±s)

表1 各組胃組織XIAP mRNA、XIAP表達(dá)比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0．01;與無(wú)效組比較，#P ＜0．01

組別 n XIAP mRNA XIAP對(duì)照組10 0．710 ±0．078 0．510 ±0．128有效組 14 1．099 ±0．051*# 0．809 ±0．082*#無(wú)效組 16 1．583 ±0．064* 1．281 ±0．215*

3 討論

IAP家族是具有強(qiáng)烈凋亡抑制作用的蛋白質(zhì)家族，其結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是桿狀病毒IAP重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)域［1，2］。凋亡抑制蛋白(IAPs)是首先在桿狀病毒中發(fā)現(xiàn)的能抑制感染昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡的蛋白家族?，F(xiàn)已知IAPs是一類(lèi)在進(jìn)化上高度保守的蛋白，廣泛存在于從昆蟲(chóng)到哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中［3］，可直接與Caspase結(jié)合，抑制細(xì)胞凋亡。因 XIAP可與Caspase29、Caspase27、Caspase23 直接結(jié)合，抑制Caspase活性，故認(rèn)為其是IAPs家族中最具潛在抑制活性的蛋白質(zhì)［4］。

體外研究證明，許多抗癌藥物的抗腫瘤作用有的是殺傷腫瘤細(xì)胞，有的是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因藥物殺傷腫瘤細(xì)胞可致細(xì)胞壞死，產(chǎn)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，故誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為現(xiàn)代抗腫瘤藥物治療的新策略。Wang等［5］研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)轉(zhuǎn)染XIAP基因，癌細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡敏感性下降。在相同濃度的絲裂霉素C誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染XIAP的膀胱癌T24細(xì)胞凋亡率均有一定程度下降;因XIAP可阻滯化療藥物誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，故對(duì)膀胱癌的多藥耐藥性發(fā)生有重要意義。Wang等［5］從卵巢癌患者腹水中可以分離出T淋巴細(xì)胞表達(dá)XIAP的剪切片段，而正常人的T淋巴細(xì)胞則無(wú)此表達(dá)，表明XIAP有較強(qiáng)的抗凋亡活性。Sasaki等［6］在卵巢癌患者耐藥機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)導(dǎo)反義XIAP不僅可增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)凋亡的敏感性，而且可激活Caspase介導(dǎo)的p53積聚。Li等［7］檢測(cè)了卵巢癌細(xì)胞中的XIAP表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)化療耐藥細(xì)胞系XIAP的表達(dá)水平明顯高于對(duì)化療藥物敏感的細(xì)胞系。本研究顯示，正常對(duì)照組、化療有效組及無(wú)效組患者的胃組織中均有XIAP mRNA表達(dá)，以對(duì)照組最低，無(wú)效組最高;其可能原因是XIAP mRNA高表達(dá)的胃癌導(dǎo)致XIAP高表達(dá)，抑制了抗癌藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，故致化療無(wú)效。本研究結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)報(bào)道［6，7］的結(jié)果相符。

總之，本研究表明XIAP可能通過(guò)細(xì)胞凋亡調(diào)控參與胃癌化療的過(guò)程，XIAP mRNA表達(dá)水平與胃癌化療療效直接相關(guān)，此為胃癌新輔助化療患者的藥物篩選提供了新的指標(biāo)。

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