王 云，劉 謙，秦明照，任 潔，劉 琦

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院，北京100730)

高血糖引起的氧化應(yīng)激不僅增加脂質(zhì)過(guò)氧化，而且增強(qiáng)血管炎癥反應(yīng)，是加速糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素［1］。硫氧還蛋白(Trx)作為氧化應(yīng)激的一個(gè)生物標(biāo)志物，可以從一個(gè)方面反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激水平，同時(shí)Trx上調(diào)具有抗氧化的作用［2，3］。有研究表明過(guò)氧化物酶體增生物激活受體α(PPARα)激活可使Trx表達(dá)上調(diào)，而核內(nèi)易位的Trx可抑制PPARα的活性［4］，在生理?xiàng)l件下二者形成一個(gè)負(fù)反饋環(huán)。高血糖刺激下應(yīng)用PPARα激動(dòng)劑對(duì)Trx的表達(dá)影響如何，相關(guān)報(bào)道較少。2009年10月～2010年6月，本研究通過(guò)檢測(cè)Trx在糖尿病大鼠主動(dòng)脈組織中的表達(dá)，應(yīng)用PPARα激動(dòng)劑非諾貝特進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察此藥對(duì)Trx表達(dá)的影響，探討糖尿病大鼠大動(dòng)脈組織中氧化應(yīng)激水平變化，藥物對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇體質(zhì)量180～200 g雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(級(jí)別SPF/VAF)，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，12 h光照周期，自由進(jìn)食水。普通飼料喂養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組(C組，n=10)和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組予普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組給予高脂高糖飼料［5］(20% 糖 +2.5% 膽固醇 +10% 脂肪，67.5 %常規(guī)普通飼料)喂養(yǎng)4周后造模。

1.2 試劑 鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma-Aldrich公司);檸檬酸和檸檬酸鈉(北京化學(xué)試劑廠)，10%水合氯醛(北京同仁醫(yī)院制劑室)，非諾貝特膠囊(法國(guó)利博福尼制藥公司惠贈(zèng))，TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)，SYBR Green PCR Master Mix(英國(guó)ABI公司)。

1.3 糖尿病大鼠模型建立 禁食12 h后，實(shí)驗(yàn)組于腹腔注射STZ(45 mg/kg)行糖尿病大鼠造模。5 d后應(yīng)用剪尾法取血測(cè)血糖，血糖值＞16.7 mmol/L即為造模成功［5］，納入本實(shí)驗(yàn)，每周監(jiān)測(cè)血糖、體質(zhì)量。隨機(jī)分為糖尿病組(A組，n=10)和藥物干預(yù)組(B組，n=10)，A組給予蒸餾水灌胃，B組給予非諾貝特100 mg/(kg·d)，共灌胃8周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中A組死亡2只，B組死亡1只。

1.4 標(biāo)本采集 全部大鼠采血前均禁食不禁水3 h，稱重后應(yīng)用10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，采用頸靜脈插管取血約3 ml，置于不含抗凝劑真空采血管中，靜置后離心(3 000 r/min)5 min，分離出血清。留取主動(dòng)脈弓、胸主動(dòng)脈組織標(biāo)本于－80℃凍存。

1.5 大鼠生化指標(biāo)測(cè)定 應(yīng)用美國(guó)Beckman公司Unicel DxC 800型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血糖，血脂各項(xiàng)包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。

1.6 大鼠主動(dòng)脈Trx mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 每只大鼠分別取主動(dòng)脈組織約100 mg(于－80℃凍存)，總RNA以TRIzol提取，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR儀(英國(guó)ABI公司ABI7300)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)檢測(cè)各組Trx mRNA水平。應(yīng)用Primer express軟件設(shè)計(jì)引物(美國(guó)Applied Biosystem公司)，引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，Trx上游引物F:5'-TCCAATGTGGTGTTCCTTGA-3';下游引物 R:5'-ATAGAACTGGAAGGTCGGCA-3'。18s上游引物F:5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3';下游引物 R:5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'。反應(yīng)參數(shù):50℃ 2 min，1個(gè)循環(huán);95℃ 2 min，1個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，50個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，95℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。18s rRNA作為cDNA定量的內(nèi)參。以管家基因18 s為內(nèi)參，計(jì)算出每個(gè)目的基因mRNA的相對(duì)含量，該值越高，表明目的基因在該模板的表達(dá)量越高。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料應(yīng)用±s表示。各組資料首先進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料分別取In對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。多組間變量比較采用單因素方差分析(ANOVA)，對(duì)ANOVA有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量進(jìn)一步采用LSD進(jìn)行兩兩組間比較。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、血糖情況比較 見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、血糖情況比較

2.2 各組大鼠血脂水平比較 單因素方差分析顯示，血脂各項(xiàng)中各組TC、TG差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。各組 LDL、HDL差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。進(jìn)一步行組間比較，結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血脂水平比較(mmol/L)

2.3 各組大鼠主動(dòng)脈組織中Trx mRNA表達(dá)比較A、B、C組大鼠Trx mRNA表達(dá)水平分別為46.24、79.11、9.68，P ＜0.05。進(jìn)一步行組間比較，A 組、B組Trx mRNA表達(dá)水平高于C組(P＜0.05)，B組高于A 組(P ＜0.05)。

3 討論

貝特類藥物是一類人工合成的PPARα的配體，也可以稱為PPARα的藥理性激動(dòng)劑。臨床上非諾貝特主要用于治療混合性高脂血癥和高三酰甘油血癥。PPARα在肝臟和腎臟中表達(dá)量很高，同時(shí)在心肌和血管組織中也有表達(dá)。激活的PPARα可以介導(dǎo)載脂蛋白apoA-1表達(dá)，促進(jìn)脂蛋白脂肪酶合成，并通過(guò)對(duì)一些目的基因表達(dá)的調(diào)控，使脂肪酸、TG和極低密度脂蛋白合成減少［6］。

本研究給予大鼠非諾貝特100 mg/(kg·d)干預(yù)，8周后檢測(cè)血清TC、TG、HDL及LDL水平，結(jié)果顯示TC、TG較對(duì)照組和糖尿病組無(wú)明顯減低，但可明顯降低LDL，同時(shí)升高HDL，這一結(jié)果與Ye等［7］的一致。本實(shí)驗(yàn)中未能看到其降低TC、TG的作用，考慮與高脂高糖飲食抑制大鼠食欲，減少其進(jìn)食量有關(guān)，在造模前實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物體質(zhì)量比對(duì)照組降低也證實(shí)此推論。但非諾貝特降低大鼠LDL，升高HDL的作用在本實(shí)驗(yàn)中是肯定的。

已有多個(gè)臨床試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)貝特類藥物在調(diào)脂同時(shí)還可以減低心血管事件的發(fā)生［8，9］，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程［10］。這些作用不僅與其降低血脂有關(guān)，而且與其參與目的基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。研究證實(shí)，在Trx的遠(yuǎn)端啟動(dòng)子區(qū)有一段過(guò)氧化物酶激活物反應(yīng)元件(PPRE)，激活的核受體PPARRXR異二聚體同這段序列發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而激活Trx基因轉(zhuǎn)錄，激活 PPARα能上調(diào) Trx的表達(dá)［4］。近期也有研究報(bào)道，在單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞中PPARα特殊的啟動(dòng)子GW647可以上調(diào)Trx基因表達(dá)。上述研究均在細(xì)胞水平上進(jìn)行，迄今在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)關(guān)于PPARα對(duì)Trx表達(dá)調(diào)控的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察了非諾貝特對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈組織中Trx mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，非諾貝特可以上調(diào)Trx mRNA表達(dá)水平，與對(duì)照組和糖尿病組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

到目前為止，已發(fā)現(xiàn)至少有60個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的活性受到氧化還原環(huán)境的影響。Trx通過(guò)對(duì)蛋白氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)，在體內(nèi)調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，如:抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、雌激素受體、糖皮質(zhì)激素受體等轉(zhuǎn)錄活性。Trx對(duì)轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控決定了Trx對(duì)基因表達(dá)的影響。在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)Trx能增強(qiáng)炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)的血紅素加氧酶的表達(dá)，從而起到細(xì)胞保護(hù)作用。另外應(yīng)用重組Trx處理細(xì)胞也能調(diào)控某些基因的表達(dá)。Das等應(yīng)用小劑量Trx即可顯著誘導(dǎo)SOD的表達(dá)，Kontou等［11］發(fā)現(xiàn)還原型Trx能上調(diào)GAPDH和IKB的mRNA水平?？梢酝茰y(cè)Trx對(duì)轉(zhuǎn)錄因子及基因表達(dá)的調(diào)控在高糖氧化應(yīng)激損傷及糖尿病大血管病變中可能具有非常重要的作用。本研究觀察到非諾貝特可以上調(diào)大鼠主動(dòng)脈組織中Trx mRNA表達(dá)水平，提示PPARα激動(dòng)劑對(duì)心血管的保護(hù)效應(yīng)是通過(guò)上調(diào)Trx的基因表達(dá)，從而影響Trx介導(dǎo)的一系列基因的轉(zhuǎn)錄活性，以發(fā)揮其抗氧化、抗炎、抑制炎癥因子生成的作用［12］，這也可以解釋非諾貝特具有調(diào)脂外的抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

本研究非諾貝特可以上調(diào)主動(dòng)脈組織中Trx mRNA表達(dá)，但我們沒(méi)有觀察非諾貝特對(duì)血清Trx的影響，而且不同劑量的非諾貝特或其他PPARα激動(dòng)劑是否影響血清Trx水平有待在今后的工作中進(jìn)一步研究。這些推論還需要進(jìn)一步的研究加以證實(shí)和探討。

［1］Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications:a unifying mechanism［J］.Diabetes，2005，54(6):1615-1625.

［2］Berk BC.Novel approaches to treat oxidative stress and cardiovascular diseases［J］.Trans Am Clin Climatol Assoc，2007，118:209-214.

［3］Billiet L，F(xiàn)urman C，Cuaz-Pérolin C，et al.Thioredoxin-1 and its natural inhibitor，vitamin D3up-regulated protein 1，are differentially regulated by PPARalpha in human macrophages［J］.J Mol Biol，2008，384(3):564-576.

［4］Liu GH，Qu J，Shen X.Thioredoxin-mediated negative autoregulation of peroxisome proliferator-activated receptor alpha transcriptional activity［J］.Mol Biol Cell，2006，17(4):1822-1833.

［5］Zhou YS，Gao Y，Guo XH，et al.Effects of timely insulin treatment on protection of beta cells in a rat model of type 2 diabetes mellitus［J］.Chin Med J(Engl)，2004，117(10):1523-1529.

［6］Duval C，Müller M，Kersten S.PPARalpha and dyslipidemia［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1771(8):961-971.

［7］Ye JM，Doyle PJ，Iglesias MA，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)-alpha activation lowers muscle lipids and improves insulin sensitivity in high fat-fed rats:comparison with PPAR-gamma activation［J］.Diabetes，2001，50(2):411-417.

［8］Tenenbaum A，Motro M，F(xiàn)isman EZ，et al.Bezafibrate for the secondary prevention of myocardial infarction in patients with metabolic syndrome［J］.Arch Intern Med，2005，165(10):1154-1160.

［9］Keech A，Simes RJ，Barter P，et al.Effects of long-term fenofibrate therapy on cardiovascular events in 9795 people with type 2 diabetes mellitus(the FIELD study):randomised controlled trial［J］.Lancet，2005，366(9500):1849-1861.

［10］Sacks FM.The relative role of low-density lipoprotein cholesterol and high-density lipoprotein cholesterol in coronary artery disease:evidence from large-scale statin and fibrate trials［J］.Am J Cardiol，2001，88(12A):14N-18N.

［11］Kontou M，Will RD，Adelfalk C，et al.Thioredoxin，a regulator of gene expression［J］.Oncogene，2004，23(12):2146-2152.

［12］Dragomir E，Tircol M，Manduteanu I，et al.Aspirin and PPAR-alpha activators inhibit monocyte chemoattractant protein-1 expression induced by high glucose concentration in human endothelial cells［J］.Vascul Pharmacol，2006，44(6):440-449.