黃 剛 張兆輝 劉美真 朱 揚(yáng) 白寅又 李 慧

腦出血是常見的急危重癥疾病,其致殘率和病死率均很高,其中一個(gè)很重要的原因是出血后水腫的形成和發(fā)展,現(xiàn)已證明腦出血后的炎癥反應(yīng)是腦水腫及繼發(fā)性功能缺損加重的的主要原因[1]。溶血磷脂酸(lysophosp hatidicacid,LPA)是具有多種生物學(xué)作用的磷脂信使,主要由活化的血小板產(chǎn)生。已有研究表明,腦出血后高濃度的LPA促進(jìn)血腦屏障通透性增加和腦水腫的形成[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞起源于胚胎前期骨髓干細(xì)胞,生理?xiàng)l件下小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息或休眠狀態(tài)。在腦出血等損傷時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞則在神經(jīng)變性和神經(jīng)炎性反應(yīng)過(guò)程中起關(guān)鍵作用[3]。Toll樣受體 4(Toll-like receptor 4 TLR4)是天然免疫系統(tǒng)識(shí)別病原微生物的主要受體,介導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)毒素(1ipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),可能導(dǎo)致了腦出血后的細(xì)胞凋亡過(guò)程[4]。目前證實(shí)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)TLR4主要在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),而在血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不表達(dá)[5]。TLR4信號(hào)成為一個(gè)激活小膠質(zhì)細(xì)胞和調(diào)節(jié)其功能的重要控制開關(guān),在腦出血后腦組織炎癥反應(yīng)中具有重要作用[6,7]。LPA是否影響TLR4的表達(dá),如何激活小膠質(zhì)細(xì)胞加重腦水腫的發(fā)展呢?本實(shí)驗(yàn)采用大鼠海馬區(qū)注射LPA,免疫組化方法檢測(cè)注射后TLR4動(dòng)態(tài)表達(dá) ,探討TLR4信號(hào)通路在腦出血繼發(fā)損傷中激活小膠質(zhì)細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

立體定位儀、微量注射器、光學(xué)顯微鏡及手術(shù)器械等,溶血磷脂酸(Sigma公司),EB(Sigma公司),TLR4多克隆抗體(武漢華瑞康公司),SP試劑盒(武漢博士德公司),DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

70只成年、雄性、健康SD大鼠,體重250～300 g,均購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,并隨機(jī)分為對(duì)照組、LPA注射后 6、24、48 h組、LPA+蘇拉明(L+S)注射后6、24、48 h組,每組各時(shí)間點(diǎn)均選10只鼠用作免疫組化檢測(cè)。

1.3 動(dòng)物模型的制作

大鼠以10%水合氯醛(0.35 m l/100g)腹腔注射麻醉后,固定于立體定位儀上,局部頭頂去毛、消毒,行頭皮正中切口,剝離骨膜,暴露前囟,確定前、后囟,并使之處于同一水平面上,參照?qǐng)D譜[8]進(jìn)行立體定位。于前囟右側(cè)2.0mm,后3.0mm處鉆一直徑約1mm的小孔,用固定于立體定位儀上的微量注射器沿鉆孔垂直進(jìn)針2.5 mm到達(dá)大鼠海馬,LPA組注射溶LPA 100 umol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)50μl,(L+S)組注射溶100 umol/LLPA+10m ol/L蘇拉明的PBS 50μl,對(duì)照組注射PBS 50 ul,注藥后留針 5 m in,退針,縫合皮膚,回籠飼養(yǎng),給予正常進(jìn)食飲水,室溫控制在25℃。

1.4 組織切片的準(zhǔn)備

各組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)用過(guò)量水合氯醛麻醉開胸,暴露心臟,分離主動(dòng)脈弓。將左心室尖用眼科剪刀剪開一小口,用16號(hào)套管針從左心室插入,進(jìn)入主動(dòng)脈弓,結(jié)扎固定,拔出針芯。同時(shí)于右心耳處剪一小口,用生理鹽水快速?zèng)_洗,直至右心耳流出的液體變清,肝臟逐漸變?yōu)榘咨珵橹?。再?%多聚甲醛的(0.1 mol/LPBS配,pH 7.4)250 m l進(jìn)行心臟灌注。固定液進(jìn)入大鼠血管后,逐漸出現(xiàn)四肢抽動(dòng)。待抽動(dòng)完全停止,全身組織器官變硬后開顱取腦,置于4%多聚甲醛中固定12 h,然后進(jìn)行石蠟包埋。在含海馬區(qū)連續(xù)冠狀切片,片厚5μm。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化,PBS(0.1 mol/L,pH 7.4)浸泡5 min。3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育 10 min,PBS洗3min×3次,滴加 TLR4多克隆抗體(1∶100)4 ℃過(guò)夜,加生物素化的羊抗兔IgG(1∶200)室溫1 h。DAB顯色,常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。每個(gè)標(biāo)本取兩張切片,在400倍光鏡下隨機(jī)觀察并取5個(gè)不重復(fù)視野,采用image pro p lus軟件分析,分析陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度(IOD),取平均值,再測(cè)量細(xì)胞分布的區(qū)域面積area,對(duì)染成黃色的細(xì)胞計(jì)算,作為細(xì)胞數(shù)N,以IOD∕(N*area)為統(tǒng)計(jì)指標(biāo),代表 TLR4表達(dá)后激活小膠質(zhì)細(xì)胞程度。

1.6 陽(yáng)性細(xì)胞判定細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和對(duì)照組之間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),在單因素方差分析有意義的基礎(chǔ)上再進(jìn)行兩組間差異性檢驗(yàn)(LSD-t檢驗(yàn)),P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組TLR4的表達(dá)

對(duì)照組神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的薄膜和胞漿可見少量棕黃色顆粒,呈分支狀,表明正常腦組織TLR4蛋白有微弱表達(dá)(圖1)。

圖1 正常情況下TLR4在小膠質(zhì)細(xì)胞即有微弱表達(dá)(DAB染色×400倍)

2.2 LPA和LPA+S對(duì)腦組織TLR4表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)顯示在大鼠海馬區(qū)注射LPA后,TLR4的表達(dá)呈一動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。注射 LPA后6 h TLR4的表達(dá)即有增加,24 h達(dá)高峰,48 h后開始下降,LPA組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn) TLR4表達(dá)較對(duì)照組均顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。LPA+S組腦內(nèi)注射后與 LPA組相比各時(shí)間點(diǎn)減少明顯(P＜0.01)(表1)。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū) TLR4陽(yáng)性表達(dá)水平(±s)

表1 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū) TLR4陽(yáng)性表達(dá)水平(±s)

注：與對(duì)照組比較,★P＜0.05;與L+S組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較,▲P＜0.01

組別 大鼠數(shù)(只)不同時(shí)間點(diǎn)TLR4表達(dá)水平IOD∕(N*area)6 h 24 h 48 h對(duì)照組 10 1.33±0.12 LPA 組 10 35.08±1.55★▲78.44±2.36★▲45.35±3.78★▲LPA+S組 10 12.56±3.14★ 25.27±2.15★ 19.97±1.88★

LPA注射后TLR4表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性部位主要為小膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)及突起內(nèi),小膠質(zhì)細(xì)胞增生,胞體肥大,突起及胞漿均著色,陽(yáng)性細(xì)胞分布普及、均一。LPA+S組可見少量染色陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞,形態(tài)基本接近正常,小膠質(zhì)細(xì)胞呈灶狀分布(圖2、3)。

圖2 LPA組注射后24 h TLR4在小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)增加(DAB染色×400倍)

圖3 LPA+S組注射后24 h TLR4在小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)減少(DAB染色×400倍)

3 討 論

腦出血損傷是典型的非感染性炎癥,形成的血腫對(duì)周圍組織的壓迫缺血造成周圍組織細(xì)胞損傷,氧自由基的產(chǎn)生及炎癥介質(zhì)的釋放是其重要機(jī)制。在人類原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá) TLR4,小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)潛在的抗原提呈細(xì)胞,在腦出血后迅速被激活,作為免疫細(xì)胞參與了腦出血的病理過(guò)程而星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TLR4水平低下,但亦有報(bào)道星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)TLR4[9]。

最近研究證實(shí) TLR4在誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,當(dāng) TLR4與配體結(jié)合后,啟動(dòng)NK-kB和IFN-b兩條信號(hào)通路,導(dǎo)致多種炎癥因子(如 TNF-α,L-1β和 L-6)、趨化因子等瀑布式釋放,加重腦損傷[10]。LPA具有促內(nèi)皮損傷,增加細(xì)胞粘附和內(nèi)皮素釋放等作用,其可能作為血管壁炎性反應(yīng)的主要啟動(dòng)因子[11]。以往研究認(rèn)為,TLR4介導(dǎo)的NF-kB信號(hào)途徑參與腦出血后的炎癥反應(yīng),加重腦組織損傷。且有實(shí)驗(yàn)表明腦出血后血漿中存在高濃度的LPA降解基底膜引發(fā)血管源性腦水腫,參與腦出血后腦水腫的形成[12]。但LPA促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖是否與TLR4的表達(dá)有關(guān)?

本實(shí)驗(yàn)觀察到在注射LPA 6h后,注射局部的微血管及其周圍 TLR4開始表達(dá),24表達(dá)最強(qiáng),以后逐漸下降。這表明,腦出血可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞從靜息狀態(tài)快速向活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變,其形態(tài)的改變、免疫顯型的變化呈一定的時(shí)間依賴性;而且血腫周圍神經(jīng)元的死亡和損傷與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化相關(guān)。蘇拉明是G-蛋白偶聯(lián)受體阻斷劑,注射 LPA+S后,TLR4的表達(dá)較LPA組明顯減少,這表明蘇拉明能明顯抑制LPA引起的TLR4的高表達(dá),同時(shí)反證了TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑在腦組織損傷所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中具有重要的作用。

近年來(lái)有關(guān)腦出血繼發(fā)性損傷發(fā)病機(jī)制和防治研究成為熱點(diǎn),對(duì)TLR4在腦出血炎癥損傷中作用機(jī)制的進(jìn)一步研究,將有助于從炎癥反應(yīng)起點(diǎn)控制的角度揭開炎癥因子參與腦出血損傷發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,闡明固有免疫的啟動(dòng)與機(jī)體基本應(yīng)激反應(yīng)性損傷之間的聯(lián)系[13]。

對(duì)于TLR4在腦出血炎癥損傷中作用的進(jìn)一步研究,將有助于揭示腦出血炎癥損傷的上游機(jī)制,可能會(huì)為以后的治療提供新的治療方向和方法,有可能為腦出血的治療提供新途徑。TLR4可能在腦出血后腦炎癥損傷中扮演重要角色。TLR4信號(hào)途徑介導(dǎo)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致多種CNS疾病的腦損傷發(fā)生,為深入闡明這些疾病的發(fā)病機(jī)制并拓展治療方法提供了新的方向。但 TLR4在神經(jīng)系統(tǒng)疾病領(lǐng)域的研究尚處于初步階段,既是人體的天然免疫防御機(jī)制,又參與過(guò)度炎性損傷,其研究前景廣闊。最近,有大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腦出血后的血腫周圍存在炎癥反應(yīng),TLR4介導(dǎo)的信號(hào)途經(jīng)是否參與腦出血炎癥反應(yīng)機(jī)制還有待于進(jìn)一步闡明。隨著TLR4功能及其下游信號(hào)通路的明確,阻斷 TLR4的功能是一個(gè)潛在的治療選擇,因此,加強(qiáng)對(duì)TLR4的研究將會(huì)為CNS疾病的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用開辟?gòu)V闊的前景。

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