羅 崗,李東芳,賈曉濤,劉正姣

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是常見的腦血管疾病,隨著我國人口老齡化進(jìn)程的加快,腦出血患者的發(fā)生率、致殘率、死亡率明顯升高 。在腦出血的患者中,50%以上主要是大腦基底節(jié)區(qū)的出血,而基底節(jié)區(qū)主要由白質(zhì)組成,因此,腦出血后主要損傷的是大腦白質(zhì)。腦白質(zhì)主要由神經(jīng)纖維組成(樹突、軸突、膠質(zhì)細(xì)胞),其在神經(jīng)系統(tǒng)中起著傳遞信息,分泌和支撐神經(jīng)元等作用,因此,腦白質(zhì)損傷(神經(jīng)纖維的斷裂、變性和壞死)對機體會產(chǎn)生十分不利的影響。髓鞘相關(guān)抑制因子(mylinassociated inhibitor factors,M AIFs)的發(fā)現(xiàn)及對其作用機制的研究成為近年研究的熱點。尤其是它的一個新成員——Ephrin-b3的重要作用成為目前關(guān)注的焦點,既往在腦梗死方面有研究,但在腦出血未見相關(guān)報道。有研究發(fā)現(xiàn)[1]Ephrin-b3表達(dá)于髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞,其抑制活性等同于p75介導(dǎo)的Nogo-66,M AG,OMgp的活性,所以以Ephrin-b3為切入點,觀察成年大鼠腦出血后其與腦白質(zhì)損傷的相關(guān)性,對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)再生具有重要意義。本研究采用自體血注入法應(yīng)用HE染色法,觀察血腫周圍組織學(xué)的變化,并測定對照組和實驗組不同時間點血腫周圍Ephrin-b3的表達(dá),探討他們之間的關(guān)系,為腦出血的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 選用成年健康雄性Wistar大鼠48只(山西醫(yī)科大學(xué)生理系動物試驗中心提供),營養(yǎng)中等,鼠齡(3～4)個月,體重250 g±15 g。Ephrin-b3試劑盒(太原市萊爾生物科技有限公司);普通試劑由山西醫(yī)科大學(xué)實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 本實驗隨機分為對照組和實驗組,對照組分為正常對照組(A組)、假手術(shù)組(B組),每組各8只;實驗組為6 h,24 h,48 h,72 h,7 d腦出血組,分別記為D組,E組,F組,G組,H組,每時相點各8只大鼠,每時相出血組分別向大鼠大腦內(nèi)囊部注射自體血100μL。

1.2.2 模型制作 大鼠術(shù)前12 h禁食,可自由飲水。參照Xue等[2]方法制備大鼠模型。用微量注射器自尾動脈分2次取自體非肝素不凝血,每次 50 μ L,共計100 μ L[3,4]。以大鼠腦切片中有明顯的圓形、橢圓形或不規(guī)則血腫存在,血液無針道反流,無蛛網(wǎng)膜下腔出血,無血腫破入腦室者為模型成功標(biāo)準(zhǔn),術(shù)后昏迷或死亡者剔除。符合模型成功標(biāo)準(zhǔn)的48只。

1.2.3 標(biāo)本制備 腦出血各時相組,對照組分別在出血模型建立成功后的 6 h,24 h,48 h,72 h,7 d后,頸椎脫臼處死,迅速取腦,各組隨機取兩只大鼠腦組織迅速固定,石蠟包埋后,在內(nèi)囊部位做冠狀位切片,厚約5 μ L,HE染色,觀察組織學(xué)變化。

1.2.4 腦組織勻漿制備與指標(biāo)的檢測 將腦組織用生理鹽水漂洗,去除表面血液,濾紙拭干,精確稱重后制備10%勻漿。低溫離心機將勻漿以3 500 r/min離心15 min,取上清液檢測Ephrin-b3,嚴(yán)格按照試劑盒提供的步驟進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用方差分析,進(jìn)行兩兩比較LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下HE染色 HE染色病理觀察,出血6 h組于血腫周圍可見變性壞死區(qū)域,細(xì)胞排列不整齊,核形態(tài)不整,部分核皺縮、髓質(zhì)均可見片狀間質(zhì)水腫,但未見炎性細(xì)胞浸潤。出血24 h組除可見變性壞死區(qū)域擴大外,細(xì)胞周圍出現(xiàn)空白區(qū),細(xì)胞分布不均勻,神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)減少,可見散在淋巴細(xì)胞浸潤。出血72 h組可見組織水腫明顯,神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)明顯減少,可見細(xì)胞崩解小體,中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤,可見中性粒細(xì)胞附壁現(xiàn)象。假手術(shù)組和正常對照組未見異常變化。

2.2 各組大鼠不同時間點Ephrin-b3水平 大鼠腦出血后6 h血腫周圍Ephrin-b3的表達(dá)較正常增多,24 h,48 h表達(dá)逐步增高,72 h表達(dá)達(dá)到高峰,與相應(yīng)時間點假手術(shù)組和正常組比較,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),出血7 d組與假手術(shù)組和正常對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表1。

表1 腦出血后不同時間點實驗組Ephrin-b3的表達(dá)(±s)

表1 腦出血后不同時間點實驗組Ephrin-b3的表達(dá)(±s)

組別 n Ephrin-b3 A組 6 0.124±0.013 B組 6 0.148±0.006 C組 6 0.306±0.0091)2)D組 6 0.519±0.0171)2)3)E組 6 0.778±0.0251)2)3)4)F組 6 1.469±0.0341)2)3)4)5)G組 6 0.136±0.0373)4)5)6)與A組比較,1)P＜0.01;與B組比較,2)P＜0.01;與C組比較,3)P＜0.01;與D組比較,4)P＜0.01;與E組比較,5)P＜0.01;與F組比較,6)P＜0.01

3 討 論

腦出血損傷主要是基底節(jié)區(qū)腦白質(zhì)的損傷,病理改變表現(xiàn)為局灶性血腫周圍白質(zhì)囊性變、凝固性壞死或彌漫性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte,OL)凋亡、壞死[5,6]。本研究發(fā)現(xiàn),實驗組在出血6 h后血腫周圍可見變性壞死區(qū)域,出血24 h組除可見變性壞死區(qū)域擴大外,細(xì)胞周圍出現(xiàn)空白區(qū),出血72 h組可見組織水腫明顯,神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)明顯減少,可見細(xì)胞崩解小體,中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤,可見中性粒細(xì)胞附壁現(xiàn)象。上述改變最重要的病理生理為血腫本身的變化及血腫周圍的繼發(fā)性損傷,其機制已比較清楚,但針對白質(zhì)損傷后的治療措施卻甚微,既往腦出血方面主要針對出血后的影響血腫擴大的相關(guān)因素進(jìn)行研究,而對于神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中分泌的神經(jīng)生長抑制因子未予足夠重視,因而人們開始逐漸將重點轉(zhuǎn)向了對血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞的研究[7]。髓鞘相關(guān)抑制因子(mylin-associated inhibitor factors,M AIFs)的發(fā)現(xiàn)及對其作用機制的研究成為近年研究的熱點。尤其是它的一個新成員Ephrin-b3的重要作用成為目前關(guān)注的焦點,既往在腦梗死方面有研究,但在腦出血未見相關(guān)報道。Eph是新發(fā)現(xiàn)的酪氨酸蛋白激酶(RTK)家族中最大的分支,其分布廣泛,結(jié)構(gòu)上高度保守,參與神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞間相互作用,并與軸突發(fā)育路徑有關(guān);Ephrin-b3是Eph家族的重要成員之一。成年時期,主要分布在突觸和神經(jīng)纖維的少突膠質(zhì)細(xì)胞中,是一種神經(jīng)纖維生長抑制因子,在突觸重塑和神經(jīng)的再生過程中有重要的意義[8]。Benson等[9]提出Ephrin-b3是一種髓鞘相關(guān)抑制因子,僅表達(dá)限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞;對Nogo,M AG,OMgp,p75基因敲除小鼠的皮質(zhì)脊髓束再生抑制發(fā)揮作用是另一個重要機制。Yiu等[10]發(fā)現(xiàn)Ephrin-b3和NgR1/p75一樣都可以激活小GTP酶RhoA,引起生長錐的塌陷,表明他們有共同的信號途徑,也充分說明了Ephrin-b3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生抑制中的重要作用。本實驗采用Elisa法定量檢測腦出血后血腫周圍組織Ephrin-b3的表達(dá)水平,結(jié)果顯示出血周圍組織的Ephrin-b3在出血后6 h開始升高,72 h達(dá)到高峰,7 d基本上恢復(fù)到正常水平,但仍高于正常水平,與HE染色觀察到血腫周圍組織損傷程度時間一致,提示Ephrin-b3參與了腦出血過程中神經(jīng)細(xì)胞損傷,其表達(dá)與腦出血后白質(zhì)損傷具有相關(guān)性。

本研究結(jié)果可以得到一個啟示,如果能夠進(jìn)一步拮抗Ephrin-b3的作用,則可以從減少生長錐塌陷和減少細(xì)胞凋亡兩個方面減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷及促進(jìn)再生,為腦出血治療提供實驗依據(jù)。

[1]Benson MD,Romero MI,Lush ME,et al.Ephrin-B3 is a myelinbased inhibitor of neurite out growth[J].PNAS,2005,102(30):10694-10699.

[2]Xue M,Del Bigio M R.Intracortical heamorrhage injury in rats:Relationship between blood fraction and brain cell death[J].Stroke,2000,31:1721-1727.

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[7]Del Bigio M R,Yan HJ,Xue M.Intracerebral infusion of a secondgeneration ciliary neurotrophic facto r reduces neuronal loss in rat striatum following ex perimental intracerebral hemorrhage[J].J Neurol Sci,2001,192(1-2):53-59.

[8]Dalva M B,Takasu MA,Lin MZ,et al.EphB receptors interact with NMDA receptors and regulate by in vivo functional imaging[J].J Neurosci,2000,20(15):5841-5847.

[9]Benson MD,Romero MI,Lush ME,et al.Ephrin-B3 is a myelinbased inhibitor of neurite outgrowth[J].PNAS,2005,102(30):10694-10699.

[10]Yiu G,He Z.Signaling mechanisms of the myelin inhibitors of axon regeneration[J].Curr Opin Neurobiol,2003,13(5):545-551.