第五永長(zhǎng),田金洲,時(shí) 晶

阿爾茨海默病(AD)可分為家族性和散發(fā)性兩大類,約占全部癡呆病例的65%,目前已成為老年人群中繼心血管病、惡性腫瘤、中風(fēng)之后的第四大“殺手”。其中,散發(fā)性老年性癡呆(SAD)約占AD的95%。與家族性AD的基因突變病因不同,SAD主要由一些遺傳性危險(xiǎn)因素、老齡以及環(huán)境性的危險(xiǎn)因素所導(dǎo)致,是老年性癡呆中最可望通過(guò)藥物干預(yù)的類型。

復(fù)方銀思維是在清代名醫(yī)陳士鐸治療呆病經(jīng)驗(yàn)方的基礎(chǔ)上經(jīng)組方及劑量?jī)?yōu)化形成的有效成分提取物。本課題較系統(tǒng)的研究了該方防治SAD認(rèn)知損害的作用及其可能機(jī)制。本文是課題研究的一部分,重點(diǎn)觀察和探討了該方對(duì)于SAD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其超微形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠84只,體重(270±20)g,由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):0034642)。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham-operated,S)、模型組(Model,M)、多奈哌齊對(duì)照組(Donepezil,D)、銀思維小劑量組(YSW Small Dose,YS)、銀思維中劑量組(YSW Middle Dose,YM)、銀思維大劑量組(YSW Large Dose,YL)。每組動(dòng)物14只。

1.2 SAD模型制備 參考Sharma等方法[1-4],除假手術(shù)組外,其余動(dòng)物注射鏈脲佐菌素(STZ)約 18 μ L。坐標(biāo)參考George Paxinos Charles Waston《大鼠腦立體定向圖譜》[5]。假手術(shù)組以等量人工腦脊液替代STZ。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)21 d后予以藥物治療。造模及飼養(yǎng)過(guò)程中動(dòng)物死亡率為19.2%。

1.3 干預(yù)藥物及給藥方法 銀思維由人參、半夏、茯神、附子、菖蒲等組成。由999企業(yè)集團(tuán)醫(yī)藥股份有限公司提供中藥提取物顆粒(產(chǎn)品批號(hào):0908032)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以60℃雙蒸水溶解稀釋,配成大、中、小劑量濃度,按生藥計(jì)算的大鼠給藥劑量為:大劑量30.42 g/(kg?d);中劑量 15.21 g/(kg?d);小劑量7.61 g/(kg?d),按0.75 mL/100(g?d)灌胃。多奈哌齊(中美合資西安海欣制藥有限公司生產(chǎn),藥物購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥房)以0.92 mg/kg劑量,按0.75 mL/100(g?d)灌胃。模型組及假手術(shù)組給予等體積的雙蒸水。各組均每日1次,共灌胃2個(gè)月。

1.4 行為學(xué)測(cè)試 采用Morris水迷宮試驗(yàn)法。定位航行實(shí)驗(yàn),空間搜索實(shí)驗(yàn)。

1.5 電鏡觀察 電鏡樣品處理:取出新鮮大鼠海馬切割成1 mm3的組織塊,投入2.5%的戊二醛固定液,固定2 h,待組織塊下沉,0.01 mol/L PBS液沖洗3次,常溫保存在0.01 mol/L PBS中,送電鏡室。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

2.1.1 定位航行試驗(yàn) 在5 d的定位航行試驗(yàn)中,各組大鼠的平均逃避潛伏期及總游泳距離都呈逐漸下降趨勢(shì),表明動(dòng)物在歷次學(xué)習(xí)訓(xùn)練過(guò)程中,學(xué)習(xí)尋找平臺(tái)的能力均得到提高。在第1天的訓(xùn)練中,模型組與假手術(shù)組平均逃避潛伏期及總游泳距離無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在隨后的4 d中兩組平均逃避潛伏期及總游泳距離表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。從第3天開始,多奈哌齊組,銀思維小、中、大劑量組與模型組相比,平均逃避潛伏期及總游泳距離有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01),其中以銀思維中劑量、大劑量差異最為顯著(P＜0.01)。第5天各治療組與模型組相比,平均逃避潛伏期及總游泳距離均呈有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。除第2天結(jié)果顯示銀思維大劑量組與多奈哌齊組相比平均逃避潛伏期及總游泳距離有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)外,其余時(shí)間多奈哌齊組與銀思維小、中、大劑量組組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表 1、表2。

表1 大鼠在定位航行試驗(yàn)中的平均逃避潛伏期比較(±s)s

表1 大鼠在定位航行試驗(yàn)中的平均逃避潛伏期比較(±s)s

組別 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天假手術(shù)組 11 76.74±25.03 1.37±10.76 20.46±10.14 12.91±3.10 10.67±6.59模型組 11 294.69±7.01 88.98±26.022) 50.96±31.852) 47.43±30.502) 40.23±34.122)多奈哌齊對(duì)照組 12 78.92±24.19 66.95±26.47 27.99±17.48 28.26±25.97 15.62±13.583)銀思維小劑量組 11 69.09±41.59 60.99±28.913) 25.89±20.463) 23.62±11.163) 16.75±13.304)銀思維中劑量組 11 56.54±19.813) 40.69±19.144) 26.62±21.433) 30.68±27.753) 19.95±23.074)銀思維大劑量組 11 66.29±20.853) 27.07±10.174)5) 19.84±11.894) 16.84±12.384) 11.19±7.984)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01;與多奈哌齊對(duì)照組比較,5)P＜0.05

表2 大鼠在定位航行試驗(yàn)中的游泳距離比較(±s)cm

表2 大鼠在定位航行試驗(yàn)中的游泳距離比較(±s)cm

組別 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天假手術(shù)組 11 968.74±368.03 676.65±408.62 334.22±175.44 231.23±22.87 179.15±105.79模型組 12 1 210.51±303.78 1 093.50±498.431) 764.34±375.982) 748.82±376.272) 601.59±409.032)多奈哌齊對(duì)照組 12 1 063.38±407.53 755.59±348.043) 451.88±272.123) 408.39±244.893) 247.31±224.994)銀思維小劑量組 11 822.28±544.56 665.53±493.533) 328.29±173.624) 316.62±146.444) 260.75±215.794)銀思維中劑量組 11 742.90±313.50 529.96±329.794) 361.29±206.504) 461.85±387.993) 307.56±310.554)銀思維大劑量組 11 968.91±400.43 422.41±204.954)5) 341.9136±171.924) 252.18±123.284) 157.18±105.474)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01;與多奈哌齊對(duì)照組比較,5)P＜0.05

2.1.2 空間探索試驗(yàn) 在第6天撤除平臺(tái)后的試驗(yàn)中,與假手術(shù)組相比,模型組表現(xiàn)出在外環(huán)區(qū)域滯留較長(zhǎng),原平臺(tái)附近活動(dòng)很少,第1象限活動(dòng)時(shí)間明顯較短,兩組第1象限活動(dòng)時(shí)間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組相比,各治療組第1象限活動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng),其中銀思維中、大劑量組在第1象限活動(dòng)時(shí)間較之差異性最為顯著(P＜0.01)。多奈哌齊組與銀思維小、中、大劑量組組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表3。

表3 大鼠空間探索試驗(yàn)第1象限活動(dòng)時(shí)間(±s)s

表3 大鼠空間探索試驗(yàn)第1象限活動(dòng)時(shí)間(±s)s

組別 n 第1象限活動(dòng)時(shí)間假手術(shù)組 11 59.49±8.56模型組 12 15.92±6.151)多奈哌齊對(duì)照組 12 41.01±10.762)銀思維小劑量組 11 39.91±13.962)銀思維中劑量組 11 52.81±4.293)銀思維大劑量組 11 56.45±5.313)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.2 大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變 假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,核膜光滑,核仁清楚,染色質(zhì)均勻分布,以常染色質(zhì)為主。其中細(xì)胞器豐富,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布規(guī)則,線粒體發(fā)達(dá),排列密集,未見腫脹,高爾基體極性明顯。神經(jīng)元軸突內(nèi)微管排列整齊成束狀,未見微管斷裂、溶解等現(xiàn)象。組織間毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)完整,毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接緊密,血管與腦組織間無(wú)間隙。

模型組大鼠海馬神經(jīng)元呈缺血樣改變,核膜、核仁尚清晰。染色質(zhì)濃縮,異染色質(zhì)增多,靠近核膜邊緣排列。細(xì)胞器結(jié)構(gòu)有不同程度損壞,線粒體腫脹并有空泡變性,可見線粒體嵴泡狀擴(kuò)張。核糖體部分解聚,部分脫顆粒,高爾基體結(jié)構(gòu)紊亂,呈部分?jǐn)U張,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,有腫脹。神經(jīng)元胞質(zhì)偶見脂褐素顆粒、溶酶體增多。神經(jīng)元軸突內(nèi)微管結(jié)構(gòu)有明顯的斷裂或溶解現(xiàn)象,多數(shù)區(qū)域微管消失,排列紊亂。毛細(xì)血管周圍有水腫,組織間隙增大,水分增多,血管通透性增大?？梢娦切湍z質(zhì)細(xì)胞明顯水腫。

中藥各治療組大鼠海馬神經(jīng)元微管無(wú)明顯斷裂和溶解,排列較整齊,軸突結(jié)構(gòu)清楚,與假手術(shù)組接近。與模型組相比,各治療組細(xì)胞病理程度均有很大改善,其中以中藥大、中劑量組效果最為顯著。電鏡下可見神經(jīng)元胞體形態(tài)規(guī)則,無(wú)固縮,神經(jīng)元核膜、核仁清楚,核染色質(zhì)分布均勻,以常染色質(zhì)為主,毛細(xì)血管周圍無(wú)水腫現(xiàn)象,組織間隙無(wú)增大。軸突軸漿豐富,線粒體結(jié)構(gòu)正常,無(wú)腫脹。胞質(zhì)細(xì)胞內(nèi)器較正常,未見水腫。中藥小劑量組微管排列尚可,部分結(jié)構(gòu)不甚清楚。

3 討 論

AD的病理特征主要為大腦局部尤其是海馬和皮層神經(jīng)元退行性病變,細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)和細(xì)胞外老年斑(senile plaque,SP)沉積。其中NFT的數(shù)量和患者的癡呆程度呈明顯的正相關(guān),被認(rèn)為是AD患者神經(jīng)原退化的病理基礎(chǔ)[6]。NFT的主要成分是由異常過(guò)度磷酸化tau蛋白聚集而形成的雙螺旋絲(paired helical filaments,PHFs)。近年研究顯示,微管相關(guān)蛋白 tau的異常過(guò)度磷酸化不僅使其喪失催化微管裝配和穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)的正常生物活性,還使其變成具有細(xì)胞毒性的分子,并促使其自身沉積為NFT[7],還可獵獲正常的微管相關(guān)蛋白,使得微管崩解,軸突變性,細(xì)胞退化及丟失,最終導(dǎo)致AD患者的認(rèn)知功能受到嚴(yán)重的損害。因此,從保護(hù)微管結(jié)構(gòu),防止軸突變性損傷著眼,抑制tau蛋白異常過(guò)度磷酸化及NFT形成,是防治SAD的重要策略。

AD屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)呆病、文癡、善忘、郁證等范疇。隨著人口老齡化加劇以及中醫(yī)藥對(duì)復(fù)雜性疾病研究的不斷深入,SAD已成為中醫(yī)藥防治老年性癡呆最有希望突破的疾病類型。中醫(yī)學(xué)在本病的防治方面積累了較為豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),該領(lǐng)域的古籍文獻(xiàn)得到越來(lái)越多的挖掘。部分名方的療效已得到長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的檢驗(yàn),極有必要對(duì)其進(jìn)行深入細(xì)致的實(shí)驗(yàn)研究,揭示其療效機(jī)制,為中醫(yī)藥防治復(fù)雜性疾病提供范例。

本實(shí)驗(yàn)所用中藥復(fù)方源自清代名醫(yī)陳士鐸治療呆病之名方,原方由人參、半夏、茯神、棗仁、附子、菖蒲等中藥組成。復(fù)方銀思維是原方精煉優(yōu)化后的有效組分提取物。全方依據(jù)中醫(yī)益氣溫陽(yáng)、開郁化痰治則擬定而成,寓消于補(bǔ),標(biāo)本兼治,具有升發(fā)陽(yáng)氣,祛逐陰邪,開郁化痰、平衡陰陽(yáng)之功效。

實(shí)驗(yàn)采用國(guó)際認(rèn)可的側(cè)腦室注射STZ擬SAD模型。自從Blokland等[8]發(fā)現(xiàn)腦室注射STZ可通過(guò)降低海馬神經(jīng)元ChAt活性而引起大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力下降之后,側(cè)腦室注射STZ制備SAD模型方面的基礎(chǔ)研究引起了許多學(xué)者的興趣。美國(guó)de laMonte教授課題組[9]通過(guò)側(cè)腦室注射STZ的方法阻斷胰島素受體自身磷酸化和內(nèi)在的酪氨酸激酶活性,損傷胰島素及胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,結(jié)果發(fā)現(xiàn),微量的STZ未引起外周血糖升高及胰腺結(jié)構(gòu)和胰島素的免疫活性改變,卻導(dǎo)致腦體積縮小,細(xì)胞丟失、神經(jīng)膠質(zhì)增生、Aβ沉積增多、tau蛋白過(guò)度磷酸化、泛素化等驚人變化,學(xué)術(shù)界一致認(rèn)為該模型成功地模擬了SAD的病理特征。STZ擬SAD模型動(dòng)物在造模后21 d即可出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙[10]。近年來(lái),這一模型被廣泛采用作為SAD及“3型糖尿病”模型,用于AD的腦能量代謝及tau磷酸化等方面的研究。

實(shí)驗(yàn)采用的Morris水迷宮系統(tǒng)是由英國(guó)心理學(xué)家 Morris于20世紀(jì)80年代初設(shè)計(jì)并應(yīng)用于與海馬功能直接相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶腦機(jī)制研究的空間學(xué)習(xí)記憶模型,它能夠較準(zhǔn)確地反映動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力,是目前進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試最為可靠的工具之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大鼠側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素可引起明顯的AD樣空間學(xué)習(xí)記憶障礙,模型組與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在學(xué)習(xí)能力測(cè)試的定位航行試驗(yàn)中,復(fù)方銀思維提取物小、中、大劑量組均能顯著縮短SAD模型大鼠在Morris水迷宮中找到平臺(tái)的游泳時(shí)間及總游泳距離;在大鼠記憶保持能力測(cè)試的空間探索試驗(yàn)中,復(fù)方銀思維提取物小、中、大劑量組均能顯著延長(zhǎng)大鼠在原平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間,增加其在原平臺(tái)附近的活動(dòng),提高大鼠搜索目標(biāo)的策略。復(fù)方銀思維提取物小、中、大劑量及西藥多奈哌齊均可提高SAD模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,且銀思維大劑量略優(yōu)于西藥多奈哌齊。從腦組織海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)來(lái)看,假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元軸突內(nèi)微管結(jié)構(gòu)完好,排列整齊成束狀。模型組大鼠海馬神經(jīng)元軸突內(nèi)微管結(jié)構(gòu)有明顯的斷裂或溶解現(xiàn)象,多數(shù)區(qū)域微管消失,排列紊亂。銀思維各治療組大鼠海馬神經(jīng)元軸突內(nèi)微管排列整齊,無(wú)明顯斷裂溶解,效果最好。側(cè)腦室注射STZ很好地模擬了SAD空間學(xué)習(xí)記憶障礙,銀思維提取物能顯著改善SAD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,其作用的超微形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)與保護(hù)微觀結(jié)構(gòu),防止軸突損害有關(guān)。

復(fù)方銀思維是中藥有效成分提取物的組合物,其中含大量的人參皂苷。人參皂苷可以上調(diào)腦內(nèi)乙酰膽堿水平和M-膽堿受體數(shù)量,提高突觸效能和結(jié)構(gòu)可塑性,抑制細(xì)胞的凋亡和壞死,促進(jìn)海馬的神經(jīng)發(fā)生,具有良好的促智、抗衰老作用[11]。方中半夏、菖蒲、茯苓等辛開、甘緩類中藥均是中醫(yī)藥治療AD的高頻藥物。推測(cè)全方明顯的改善學(xué)習(xí)記憶作用是上述藥物及其有效成分的協(xié)同功效。對(duì)其改善SAD學(xué)習(xí)記憶障礙的深層機(jī)制與作用靶點(diǎn)值得進(jìn)一步深入研究。

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