郭麗君,袁慧欣,闞衛(wèi)軍,喬振華,薛福平

腦組織局部神經(jīng)細(xì)胞過度凋亡是造成腦缺血再灌注損傷的主要原因之一。近來研究發(fā)現(xiàn),重組人紅細(xì)胞生成素(rh-EPO)對腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護作用[1],可能與抑制線粒體凋亡途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān),而rh-EPO對腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制蛋白(XIAP)、Smac蛋白表達(dá)的影響鮮見報道。本研究觀察了大鼠腦缺血再灌注損傷后XIAP及Smac蛋白表達(dá)的變化情況,探討 rhEPO對 XIAP及Smac蛋白表達(dá)的影響及神經(jīng)保護作用的可能分子機制,為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康雄性Wistar大鼠70只,體重220 g～250 g,山西醫(yī)科大學(xué)生理實驗室提供。XIAP兔抗大鼠多克隆抗體(博奧森公司);Smac兔抗大鼠多克隆抗體、TUNEL凋亡檢測試劑盒、DAB顯色劑(均購自北京中杉金橋);rh-EPO(成都地奧);0.23 mm市售漁線;BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)、PM-10AD光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 參照Zea longa線栓法加以改良制備大鼠右側(cè)大腦中動脈阻斷(MCAO)局灶性腦缺血再灌注模型[2]。阻閉1 h后抽出漁線,恢復(fù)再灌注。假手術(shù)組置入10 mm即可,余步驟同模型組。在缺血期間及再灌注后1h保持體溫在(37±0.5)℃。

各組均在術(shù)后1 h～2 h大鼠清醒時參照Bederson評分標(biāo)準(zhǔn)[3]進行神經(jīng)功能缺失體征評分。造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn):以清醒后左側(cè)前肢不能完全伸展,前進時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈、傾倒,并出現(xiàn)霍納征為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn),不成功者剔除,再隨機補充。

1.2.2 分組及標(biāo)本制備 實驗分為3組,假手術(shù)組 20只,缺血組及 rh-EPO治療組,每組25只。于再灌注后即刻,假手術(shù)組及缺血組腹腔內(nèi)注入0.3mL生理鹽水;治療組腹腔內(nèi)注入rh-EPO(2 500 U/kg),共 5 d。分別于再灌注后 6 h、12 h、24 h、72 h、7d處死大鼠,斷頭、取腦,去除小腦與腦干,在視交叉前后1 mm范圍切取組織,于4%多聚甲醛中4℃固定24 h,常規(guī)梯度乙醇脫水,石蠟包埋,連續(xù)切取厚約 3 μ m的冠狀切片,行TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡、免疫組化檢查。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 按照原位TUNEL試劑盒說明書進行凋亡染色,細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。

1.3.2 Smac、XIAP蛋白免疫組化染色檢查采用SP法,具體操作步驟按說明書進行。顯微鏡下胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞,每只動物隨機取3張切片,每張切片在400倍視野下隨機選取不重疊的5個視野計數(shù),取均數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 缺血組中各時間點凋亡細(xì)胞數(shù)均顯著增加;rh-EPO組陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)均明顯減少,著色較淺,與缺血組、假手術(shù)組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 Smac蛋白表達(dá) 假手術(shù)組偶見少量散在Smac蛋白陽性表達(dá),位于胞漿,黃染;缺血組于再灌注6 h有大量Smac陽性細(xì)胞出現(xiàn),位于神經(jīng)元胞漿及胞核,24 h到達(dá)高峰,隨后減少,72 h基本降至正常。與缺血組比較,rh-EPO組各時間點Smac陽性細(xì)胞均減少(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠皮質(zhì)Smac蛋白陽性表達(dá)(±s)

表1 各組大鼠皮質(zhì)Smac蛋白陽性表達(dá)(±s)

組別 6 h 12 h 24 h 72 h 7 d假手術(shù)組 2.67±0.23 3.25±0.94 4.62±1.06 3.78±1.56 2.69±0.51缺血組 31.21±2.31 46.78±3.21 50.67±2.84 37.82±1.93 30.65±3.92 rh-EPO 組 19.76±3.571) 29.62±3.251) 32.61±5.931) 25.76±4.251) 20.68±1.931)與缺血組比較,1)P＜0.05

2.3 XIAP蛋白表達(dá) 胞漿或胞核上見黃染者即為陽性細(xì)胞。再灌注6 h大鼠XIAP的表達(dá)增多,12 h達(dá)高峰,之后逐漸下降,72 h XIAP的表達(dá)雖然較假手術(shù)稍高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與缺血組比較,rh-EPO組各時間點XIAP陽性細(xì)均增加,

72 h仍較6 h明顯升高,7 d降至正常。詳見表2。

表2 各組大鼠皮質(zhì)XIAP蛋白陽性表達(dá)(±s)

表2 各組大鼠皮質(zhì)XIAP蛋白陽性表達(dá)(±s)

組別 6 h 12 h 24 h 72 h 7 d假手術(shù)組 9.21±0.78 14.52±4.06 13.24±3.81 12.89±4.12 10.67±2.14缺血組 14.08±6.21 20.92±5.43 17.31±5.35 15.67±4.95 14.92±6.78 rh-EPO 組 21.65±6.271) 39.87±4.561)2) 34.64±3.721)2) 28.92±3.411)2) 23.62±1.531)與缺血組比較,1)P＜0.05;與 rh-EPO組6 h比較,2)P＜0.05

3 討 論

腦缺血再灌注后,腦組織可發(fā)生壞死和凋亡兩種死亡形式,梗死中心以壞死為主,梗死邊緣區(qū)(即缺血半暗帶)以凋亡為主,由于凋亡早期改變是可逆的,因此,挽救缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元,減少神經(jīng)元凋亡的發(fā)生,就能明顯減輕腦梗死的程度和范圍。

rh-EPO作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一個新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和神經(jīng)營養(yǎng)及保護因子,對腦缺血再灌注損傷有保護作用。降低谷氨酸鹽毒性;抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡;誘導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,直接或間接影響神經(jīng)傳導(dǎo);減輕炎癥反應(yīng);直接的抗氧化作用;保護腦血管內(nèi)皮,促進腦血管增生等[4,5]。

rh-EPO抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡與Caspase通路密切相關(guān)。rh-EPO可通過阻斷Caspase-3、Caspase-9等的激活[6],上調(diào)bcl-2和bcl-xl基因表達(dá),對抗凋亡的發(fā)生[7]。而 rh-EPO對腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞XIAP、Smac蛋白表達(dá)的影響鮮見報道。

XIAP是一種內(nèi)源性凋亡蛋白抑制劑,被認(rèn)為是迄今作用最強的內(nèi)源性Caspases抑制因子,其特征性功能結(jié)構(gòu)為氨基端的3個桿狀病毒重復(fù)序列結(jié)構(gòu)(Baculoviral IAP repeat,BIR)及羧基端具有泛素連接酶E3活性的環(huán)指結(jié)構(gòu)域(Ring finger domain,RING)[8]。XIAP抑制Caspase的活性:直接通過BIR結(jié)構(gòu)域與Caspases-3、Caspase-7、Caspase-9結(jié)合而抑制其活性;通過RING指結(jié)構(gòu)域的泛素化、溶酶體降解而抑制Caspases降解。本實驗觀察到,再灌注6 h神經(jīng)元中XIAP蛋白表達(dá)增高,12 h達(dá)高峰,以后受到表達(dá)上調(diào)的Smac抑制、Caspase-3激活后的降解增強及自身進行泛素化而降解,很快下降,至72 h恢復(fù)正常。治療組XIAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,且72 h還有較強表達(dá),提示治療組可能通過促進XIAP表達(dá)或抑制其降解,從而抑制Caspase活性、保護神經(jīng)功能,對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

Smac(第二種天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶激活物)是一種重要的促凋亡蛋白[9],可負(fù)性調(diào)控XIAP抑制Caspases活性的作用。正常情況下Smac位于線粒體內(nèi)膜腔,受到凋亡信號刺激線粒體膜孔開放后移位到胞漿,與Apaf-1凋亡復(fù)合體、XIAP的BIR3、BIR2結(jié)構(gòu)域競爭性結(jié)合解除其對Caspase-9、Caspase-3的抑制,及拮抗XIAP環(huán)指結(jié)構(gòu)域泛素連接酶E3活性等多種途徑增加細(xì)胞對凋亡信號的敏感性,促進細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]。本實驗結(jié)果顯示,正常腦組織中有少量Smac蛋白表達(dá),腦缺血再灌注后Smac蛋白表達(dá)逐漸增高,高峰出現(xiàn)在再灌注24 h,并且少量細(xì)胞表現(xiàn)為核染色陽性,說明Smac參與了腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡過程。治療組Smac陽性細(xì)胞數(shù)減少,提示治療組可能通過減少Smac表達(dá),對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

rh-EPO對腦缺血再灌注損傷有明顯的神經(jīng)保護作用,提高神經(jīng)功能,減少腦組織凋亡細(xì)胞數(shù),可能與抑制Smac蛋白表達(dá),增加XIAP蛋白表達(dá)有關(guān)。rh-EPO可影響XIAP/Smac通路,減輕腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷及細(xì)胞凋亡,是rh-EPO腦保護作用的分子機制之一。

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