滿德慧，鄧尚貴，唐 艷，黃 薇，沈璐璐

（浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316000）

食品工業(yè)中面臨的最大難題之一是食品的保藏。為了防止食品的變質(zhì)、腐敗，延長(zhǎng)食品的儲(chǔ)存期，一般采用冷藏、殺菌、密封包裝等手段，或在食品中添加防腐劑。目前市場(chǎng)上常用的防腐劑多為苯甲酸鈉、山梨酸鉀、亞硝酸鹽等化學(xué)防腐劑，經(jīng)長(zhǎng)期研究，發(fā)現(xiàn)其有誘癌性、致癌性和易引起食物中毒等毒副作用[1]。為此人們開(kāi)始關(guān)注尋求新的、無(wú)毒副作用的天然生物源防腐劑。已有研究表明，藥食兩用的竹蓀、地膚子、魚(yú)腥草和藜蒿等4種植物具有一定的抑菌作用[2-10]。本文選用竹蓀Dictyophora indusiata、地膚子Kochia scoparia和魚(yú)腥草Houttuynia cordata和藜蒿Artemisia selengensis Turcz為原料，提取抑菌活性成分，通過(guò)對(duì)4種植物提取物的復(fù)配研究，以期制備一種健康、無(wú)毒副作用、廣譜型天然生物防腐劑，為食品工業(yè)中防腐抑菌3面的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

竹蓀：購(gòu)于福建省古田縣；地膚子、魚(yú)腥草：購(gòu)于浙江省舟山市某大藥房；藜蒿：購(gòu)于江西省南昌市。將原材料烘干、粉碎，雙層保鮮袋封裝置后于干燥皿中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和菌種

無(wú)水乙醇、95%乙醇、乙酸乙酯等，試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉、酵母膏、細(xì)化瓊脂粉。

供試菌株：大腸桿菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、沙門(mén)氏菌Salmonella sp.、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院菌種保藏中心。

1.3 主要儀器設(shè)備

pH計(jì)（DECTA320A/C），梅特勒托利多公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1F）,蘇州凈化設(shè)備有限公司；壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-30522），上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；水浴恒溫振蕩器（SHA-B），江蘇金壇市億通電子有限公司；空氣恒溫振蕩器（THZ-C），太倉(cāng)市科教器材廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋（SHY-3），上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；奧林巴斯生物顯微鏡（YS100），日本奧林巴斯公司；電子天平（BS110），北京賽多利斯天平有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（HWS-270），寧波東南儀器制造有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（U-2800），日本日立公司；高速冷凍離心機(jī)（CR21G），日本日立公司；渦旋震蕩混合器（VSRTEX-6），海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；數(shù)碼相機(jī)（A610）,日本佳能公司；優(yōu)普超純水機(jī)（UPK-Ⅱ-660L），上海優(yōu)普純水儀器設(shè)備有限公司；牛津杯購(gòu)于北京先驅(qū)威鋒生物耗材有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品處理

分別稱取竹蓀、地膚子、魚(yú)腥草和藜蒿干粉各5 g，裝入250 mL三角瓶中，加200 mL 95%乙醇，浸泡，60℃水浴恒溫水浴中浸提3次，每次2 h，4 000 r/min離心10 min過(guò)濾，減壓濃縮為5 mL（以原料質(zhì)量計(jì)，含量相當(dāng)于1.0 g/mL）。

1.4.2 抑菌測(cè)定方法

用牛津杯雙層平板法[11]測(cè)定竹蓀、地膚子、魚(yú)腥草和藜蒿提取原液的抑菌譜，具體操作過(guò)程為牛津杯雙層平板法檢測(cè)平板的制備：在無(wú)菌培養(yǎng)皿中倒入10 mL加熱融化的2%滅菌瓊脂，待其充分冷卻凝固后，放入已滅菌的牛津杯數(shù)個(gè)，并按一定次序排放整齊。將分裝于大試管中的15 mL固體檢測(cè)培養(yǎng)基融化后冷卻至50℃左右，加入107CFU/mL指示菌液1 mL，渦旋混合振蕩器上迅速混合均勻，倒入培養(yǎng)皿。培養(yǎng)基冷卻后，用無(wú)菌鑷子取出牛津杯，作為活性物質(zhì)提取原液抑菌活性檢測(cè)平板。將4種不同物質(zhì)的提取液，用一次性移液槍頭吸取100～200 μL作為待測(cè)樣品，以無(wú)菌操作加入到檢測(cè)平板圓孔內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，3次平行試驗(yàn)。觀察并測(cè)定抑菌圈直徑(mm)。

1.4.3 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定方法

根據(jù)連續(xù)稀釋法[12]，將上述竹蓀、地膚子、魚(yú)腥草和藜蒿4種提取原液分別稀釋成1.5、1.0、0.75、0.5、0.25 g/mL 5種濃度的提取液，向各培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入2 mL不同濃度的提取液，每個(gè)濃度作3個(gè)重復(fù)。然后每皿倒入20 mL已溶化的固體培養(yǎng)基充分混勻，每皿加入0.2 mL菌懸液涂勻，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，3次平行試驗(yàn)。觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低提取物濃度為竹蓀、地膚子、魚(yú)腥草和藜蒿提取液的最低抑菌濃度(MIC)。試驗(yàn)中用無(wú)菌水作空白對(duì)照。

1.4.4 最佳復(fù)配比優(yōu)化方法

根據(jù)竹蓀、地膚子、魚(yú)腥草和藜蒿4種植物提取液濃度進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以大腸桿菌抑菌圈直徑為考察指標(biāo)，得到對(duì)大腸桿菌抑菌效果較好的復(fù)配比。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 4 種提取物對(duì)5種供試菌的抑菌活性

采用100%濃度母液分別對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和副溶血性弧菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1，表1結(jié)果表明提取液對(duì)5種菌種均有較好的抑制作用。藜蒿對(duì)副溶血性弧菌的抑制效果最為突出，抑菌圈直徑達(dá)到26.50 mm，明顯高于對(duì)其他4種細(xì)菌的抑制作用；魚(yú)腥草對(duì)大腸桿菌的抑菌效果也比較明顯，抑菌圈直徑達(dá)到22.05 mm，高于對(duì)其他4種細(xì)菌的抑制作用；竹蓀對(duì)副溶血性弧菌的抑菌圈直徑達(dá)到21.75 mm，抑菌效果比其他4種菌好；地膚子對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和副溶血性弧菌5種菌抑制效果均低于其他3種提物，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈最大，僅為15.00 mm。

表1 提取原液抑菌圈直徑Tab.1 Antibacterial circle diameter of extraction stoste

2.2 4 種提取物對(duì)5種供試菌的最低抑菌濃度（MIC）

由表2～5可知，竹蓀、地膚子、魚(yú)腥草和藜蒿提取液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和副溶血性弧菌的 MIC 分別為 0.75 g/mL、1.0 g/mL、1.5 g/mL、1.5 g/mL、0.75 g/mL；1.0 g/mL、1.5 g/mL、1.5 g/mL、1.5 g/mL、1.0 g/mL；1.0 g/mL、1.0 g/mL、1.5 g/mL、1.5 g/mL、1.0 g/mL、0.75 g/mL、1.0 g/mL、1.0 g/mL、1.5 g/mL、0.75 g/mL。結(jié)果表明，竹蓀和藜蒿提取液對(duì)大腸桿菌和副溶血性弧菌具有較低的抑菌濃度，地膚子和魚(yú)腥草提取液對(duì)5種供試菌的最低抑菌濃度較竹蓀和藜蒿高。

表2 竹蓀提取液的MICTab.2 MIC of extraction from D.indusiata

表3 地膚子提取液的MICTab.3 MIC of extraction from K.scoparia

表4 魚(yú)腥草提取液的MICTab.4 MIC of extraction from H.cordata

表5 藜蒿提取液的MICTab.5 MIC of extraction from A.selengensis

2.3 4 種提取物復(fù)配后對(duì)5種供試菌的抑菌活性

由表6可知，4種提取液對(duì)大腸桿菌抑菌效果作用不一，作用效果為藜蒿＞魚(yú)腥草＞竹蓀＞地膚子。分析極差結(jié)果可知，A1B2C1D3為最佳組合，即竹蓀、地膚子、魚(yú)腥草和藜蒿的復(fù)配比為：4：3：6：3，此時(shí)大腸桿菌的的抑菌圈直徑達(dá)到25.36 mm。

表6 復(fù)配浸提液抑菌的正交試驗(yàn)表Tab.6 Orthogonal test of inhibition zone of combined plant extracts

3 結(jié)論

本文對(duì)竹蓀、地膚子、魚(yú)腥草和藜蒿4種植物，采用乙醇浸提法進(jìn)行提取，用牛津杯雙層平板法分析了4種提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和副溶血性弧菌等5種供試菌進(jìn)行了抑菌測(cè)定，結(jié)果表明：試驗(yàn)中的4種植物醇提液對(duì)大腸桿菌等5種供試菌有較好的抑菌效果，其中藜蒿對(duì)副溶血性弧菌的抑制效果最為突出，抑菌圈直徑達(dá)到26.50 mm；魚(yú)腥草對(duì)大腸桿菌的抑菌效果也比較明顯，抑菌圈直徑達(dá)到22.05 mm；竹蓀對(duì)副溶血性弧菌的抑菌圈直徑達(dá)到21.75 mm；地膚子對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和副溶血性弧菌5種菌抑制效果均低于其他3種材料，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈最大，僅為15.00 mm。測(cè)定竹蓀、地膚子、魚(yú)腥草和藜蒿對(duì)5種供試菌的最低抑菌濃度，其中竹蓀和藜蒿醇提液對(duì)大腸桿菌和副溶血弧菌具有較低的抑菌濃度為0.75 g/mL，地膚子和魚(yú)腥草提取液對(duì)5種供試菌的最低抑菌濃度較竹蓀和藜蒿高。

通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果表明，4種醇提液按照4：3：6：6的比例復(fù)配后，對(duì)大腸桿菌的抑菌效果要明顯強(qiáng)于使用單一醇提液的效果，這說(shuō)明復(fù)配各成分之間存在協(xié)同作用，表明通過(guò)對(duì)多種活性成分進(jìn)行復(fù)配是一種很好的加強(qiáng)抑菌作用的方法。

[1]賈士儒.生物防腐劑[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2009.

[2]UKAI S,HARA C,KIHO T.Polysaccharides in fungi IX.A β-D-glucan from alkaline extract of Dlctyophora indusiata Fish[J].Chem Pharm Bul1,1982,80(6):2147-2154.

[3]韓 慧,張 剛,郝景雯,等.長(zhǎng)裙竹蓀抑菌作用研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2008,29(5):129-131.

[4]楊 威,吳素蕊,樊 建,等.棘托竹蓀菌絲體抑菌作用研究[J].中國(guó)食用菌,2008,27(6):34-37.

[5]吳 靜,蘇學(xué)友,師光祿,等.地膚子甲醇萃取物殺菌抑菌活性成分的初步研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2008,24(12):381-384.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.2005年版.一部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:155.

[7]牛玉樂(lè),李 焱,孫 艷,等.復(fù)方魚(yú)腥草口服液提取工藝研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(1):76-77.

[8]付 明,牛友芽,胡 興,等.藜蒿成分及開(kāi)發(fā)利用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(7):2803-2804;2929.

[9]沈夕坤,王玳珠,江國(guó)榮.蔞蒿藥理作用的初步研究[J].藥學(xué)進(jìn)展,1999,23(1):41-43.

[10]尹衛(wèi)東,喬海霞,張玉妥,等.藜蒿提取物對(duì)臨床常見(jiàn)念珠菌的體外抗菌活性[J].山東醫(yī)藥,2009,49(3):25.

[11]何 寧,王昌祿,顧曉波,等.杯碟法檢測(cè)乳酸菌素活性優(yōu)化條件的研究[J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),1999(2):17-20.

[12]張 偉,崔 同,檀建新,等.蜂膠對(duì)食品致病菌抑菌作用研究[J].食品科學(xué),1998,19(3):40-43.