張小軍，陳雪昌，郭遠明，梅光明，龍 舉，薛 彬，鄭 斌

（1.浙江海洋學院海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316100；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 316000）

麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poisons,PSP)是目前世界上分布最廣的一種貝類毒素[1]。目前在所有的貝類產(chǎn)品食物中毒事件中，麻痹性貝類中毒是公認的對健康危害最嚴重的類型之一。PSP中以石房蛤毒素（STX）、新石房蛤毒素（neoSTX）、脫氨甲?；惗舅?neoSTX、dcneoSTX)最為常見。PSP在貝類體內(nèi)呈結(jié)合狀態(tài)，因而貝類攝入此毒素對自身不會造成危害；當人攝入含麻痹性貝類毒素的食物后，毒素會迅速釋放并呈現(xiàn)毒性作用，潛伏期僅數(shù)分鐘或數(shù)小時，癥狀包括四肢肌肉麻痹、頭痛惡心、流涎發(fā)燒、皮疹等，嚴重的會導致呼吸停止[2]。

目前貝類毒素的檢測方法有小鼠生物測定法[3-4]、電泳法[5]、高效液相色譜法[6-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-11]等。在這些檢測方法中小鼠生物法是目前最常用的方法，由于小鼠生物法缺乏準確的定量性，且不能對具體毒素進行定性，從而限制了方法的應用；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其特異性好、靈敏度高等特點在近年來被用于麻痹性貝類毒素的測定。本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對4種麻痹性貝類毒素STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX進行研究，建立了分析速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品為貽貝，購自舟山市某水產(chǎn)品批發(fā)市場。

麻痹性貝類毒素標準品:STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX購自加拿大海洋生物科學研究所(NRC)；甲醇、乙腈、乙酸銨均為色譜純；其余試劑均為分析純；實驗用水為超純水。10 μg/mL PSP標準儲備溶液：準確移取適量PSP標準溶液用3 mmol/L鹽酸水溶液定容至100 mL，溶液-18℃保存。PSP標準使用液：將標準儲備溶液用3 mmol/L鹽酸水溶液逐級稀釋獲得適當濃度的混合標準使用液。

1.2 實驗儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（ACQUITY UPLC／QUATTRO Premier XE，Waters公司）；勻漿機（T18，德國 IKA 公司）；漩渦混合器（MS2，德國 IKA 公司）；高速離心機(Centrifuge5810，Eppendorf公司)；氮吹儀（N-EVAP112，Organomation公司）；Waters OASIS HLB 固相萃取柱（3 cc/500 mg，Waters公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

稱取5.0 g(精確至0.01 g)勻漿后的貝類試樣至50 mL離心管中，加入20 mL 0.1 mol/L乙酸后渦旋混勻30 s，超聲提取5 min，然后5 000 r/min離心5 min，收集上清液于50 mL離心管中。Waters OASIS HLB固相萃取柱用3 mL甲醇、3 mL 0.03 mol/L乙酸水溶液活化，取5 mL上清液過柱，收集濾液過0.22 μm濾膜后上機測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱2.1 mm i.d.×50 mm 粒徑1.7 μm；柱溫40℃；樣品溫度10℃；進樣量:10 μL；流速0.15 mL/min；流動相A為含2 mM乙酸銨和0.1%甲酸的水溶液，B為乙腈，以70%A和30%B等度洗脫。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓：3.5 kV；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：380℃；錐孔氣流量：50 L/h；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜多反應監(jiān)測實驗條件見表1。

表1 質(zhì)譜多反應監(jiān)測實驗條件Tab.1 Conditions of multiple reaction monitoring(MRM)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件選擇

PSP是強極性化合物[1]，在普通的C18柱上保留較差，很難將各組分分離。UPLC雖然不能將PSP各組分完全分離，但可以將分析物和雜質(zhì)分離，并將分析物富集。PSP在UPLC上分離富集后，由高特異性的串聯(lián)質(zhì)譜檢測，仍可達到定量分析的目的。實驗通過對不同濃度的甲酸和乙酸銨作為水相流動相研究比較，采用0.1%的甲酸和2 mM乙酸銨作為水相洗脫液，使PSP目標物在1 min內(nèi)出峰，峰型尖銳，顯著提高了靈敏度。STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX在貽貝樣品中的加標質(zhì)譜離子流圖如圖1所示。

將各PSP標準溶液以1.0 mg/kg的濃度進樣進行質(zhì)譜條件優(yōu)化，以一級質(zhì)譜掃描模式獲得母離子的分子離子峰和錐孔電壓；以子離子掃描模式進行子離子條件優(yōu)化，獲得定性、定量子離子和碰撞電壓。優(yōu)化后的母離子、子離子的質(zhì)譜多反應監(jiān)測參數(shù)見表1。

2.2 線性范圍與檢出限

用 STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX 標準使用液配制濃度分別為 2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的標準工作溶液，進樣后制作標準曲線。4種PSP在2.0～50.0 μg/L范圍內(nèi)方法線性良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.998 4～0.999 7。將加標濃度逐級稀釋添加于樣品中測定信噪比，最終按照10倍信噪比來確定該方法中STX、dc－STX、neoSTX、dcneoSTX 定量檢出限均為 10.0 μg/kg。

2.3 回收率與精密度

以紫貽貝為基質(zhì)，分別添加濃度為10.0、20.0、50.0 μg/kg的PSP進行回收率和精密度實驗，實驗結(jié)果見表2。該方法添加濃度在10.0～50.0 μg/kg之間的回收率為77.4%～90.8%，相對標準偏差為3.87%～6.37%，表明方法重現(xiàn)性好、精密度高，適用于貝類樣品中麻痹性貝類毒素的檢測。

圖1 STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX在貽貝空白樣品中加標20.0 μg/kg的色譜圖Fig.1 Chromatogram of blank mussel spiked with STX,dcSTX,neoSTX and dcneoSTX at 20.0 μg/kg

表2 貽貝樣品加標回收率和精密度Tab.2 Recovery and precision of the method from fortified mussel samples

3 結(jié)論

建立了STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX 4種麻痹性貝類毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，采用BEH C18色譜柱分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測。方法分析速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可廣泛適用于貝類中麻痹性貝類毒素的測定。

[1]劉紅河,劉桂華,毛麗莎.麻痹性貝類毒素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法研究[J].實用預防醫(yī)學,2008,15(4):1 024-1 027.

[2]李淑冰,李惠珍,許旭萍.貝毒素的研究現(xiàn)狀及產(chǎn)生源探究[J].福建水產(chǎn),2000(1)：70-74.

[3]TURRELL E A,STOBO L.A comparison of the mouse bioassay with liquid-chromatography-mass spectrometry for the detection of lipophilic toxins in shellfish from Scottish waters[J].Toxicon,2007,50(3):442-447.

[4]YASUMOTO T,OSHIMA Y,YAMAGUCHI M.Occurrence of a new type of shellfish poisoning in the Tohoku district[J].Bull Jpn Soc Sci Fish,1978,44:1 249-1 255.

[5]SHOPTAUGH N H,BUCKLEY L J,IKAWA M,et al.Detection of gonyaulax toxins and other guanidine compounds on thinlayer silica gelchromatograms[J].Toxicon,1978,16:509-513.

[6]陳 迪,方曉明,樊 祥,等.過氧化氫柱前熒光衍生化液相色譜法測定麻痹性貝毒的研究[J].分析化學,2006,34(7):933-936.

[7]LAWRENCE J F,NIEDZWIADEK B,MENARD C.Quantitative determination of paralytic shellfish poisoning toxins in shellfish using prechromatographic oxidation and liquid chromatography with fluorescence detection:collaborative study[J].J AOAC Int,2005,88:1 714-1 732.

[8]YU R C,HUMMERT C,LUCKAS B.A Modified HPLC Method for Analysis of PSP Toxins in Algae and Shellfish from China[J].Chromatographia,1998,48(9):671-676.

[9]趙貴平,蔣宏健,李 丹.LC/MS/MS檢測海洋中貝類毒素[J].環(huán)境化學,2009,28(6):961-962.

[10]SAYFRITZ S J,AASEN J A B,AUNE T.Determination of paralytic shellfish poisoning toxins in Norwegian shellfish by liquid chromatography with fluorescence and tandem mass spectrometry detection[J].Toxicon,2008,52(2):330-340.

[11]劉紅河,楊 俊,陳裕華.親水作用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測定海產(chǎn)品中麻痹性貝類毒素[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2010,37(7):1 328-1 332.