馬恒甲，葉金云，郭建林，王友慧，沈斌乾，陳建明，潘 茜

（1.大連海洋大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧大連 116023；2.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001；3.湖州師范學(xué)院，浙江湖州 3130001）

草魚(yú)Ctenopharyngodon idellus屬鯉形目Cypriniformes、鯉科Cyprinidae、雅羅魚(yú)亞科Leuciscinae、草魚(yú)屬Ctenopharyngodon，是我國(guó)最重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一，其飼料蛋白源主要為植物性蛋白源[1]。近幾年，由于魚(yú)粉供應(yīng)不足，價(jià)格不斷上漲，人們廣泛研究用廉價(jià)的植物蛋白來(lái)替代魚(yú)粉作為蛋白源，但植物中含有大量的植酸(phytic acid)及其植酸鹽[2]，植酸的化學(xué)名稱(chēng)是環(huán)已六醇六磷酸酯，分子式為 C6H18O24P6，分子量為660.08，是一種黃色液體，呈強(qiáng)酸性，易溶于水，其化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了它對(duì)其它離子有很強(qiáng)的絡(luò)合性，能夠與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽等形成絡(luò)合物從而阻礙魚(yú)類(lèi)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用[3]，植酸還可以與蛋白質(zhì)和氨基酸形成絡(luò)合物，從而抑制消化酶的活性[4]，是飼料中重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子。

植酸酶(phytase)屬磷酸單酯水解酶，可將植酸分解為可利用的無(wú)機(jī)磷酸鹽和肌醇[5]，已有研究表明，植酸酶能夠使與植酸結(jié)合的內(nèi)原性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等游離出來(lái)，提高消化率[6]。但魚(yú)類(lèi)消化系統(tǒng)內(nèi)缺乏內(nèi)源性植酸酶[7]，使其對(duì)植物飼料源中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率降低，從而抑制體內(nèi)消化酶的活性，影響?hù)~(yú)體的生長(zhǎng)和健康，所以人們一直對(duì)植酸酶在飼料中的應(yīng)用研究十分關(guān)注。

關(guān)于草魚(yú)全植物蛋白飼料中添加植酸酶對(duì)其生長(zhǎng)等影響的研究至今未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)通過(guò)在全植物蛋白飼料中添加植酸酶，研究和探討植酸酶對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)、非特異性免疫及消化酶活力的影響，旨在為草魚(yú)高效環(huán)保型飼料配方的研制和草魚(yú)環(huán)境友好型養(yǎng)殖技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)共設(shè) 5 個(gè)試驗(yàn)組：分別添加 500(S1)、750(S2)、1 000(S3)、1 250(S4)、2 500 U/kg(S5)的植酸酶，設(shè)置2個(gè)對(duì)照組，對(duì)照組1(D1)：全植物蛋白基礎(chǔ)飼料中添加無(wú)機(jī)磷(Ca(H2PO4)2)，對(duì)照組2(D2)：全植物蛋白基礎(chǔ)飼料中不添加植酸酶和無(wú)機(jī)磷，飼料配方見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)成分含量(干物質(zhì)基礎(chǔ)%)Tab.1 Composition and nutrient levels of the experimental diets(dry matter basis%)

1.2 試驗(yàn)魚(yú)和飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)魚(yú)采用健康的一冬齡草魚(yú)魚(yú)種，初始體重為(39.68±3.05)g。

養(yǎng)殖試驗(yàn)在浙江省淡水水產(chǎn)研究所特種水產(chǎn)苗種基地流過(guò)式養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，共21個(gè)玻璃纖維水族缸(D 150 cm)。將試驗(yàn)魚(yú)隨機(jī)分成7組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15尾魚(yú)，每天08:30、12:30、16:30定時(shí)換水，飽食投飼，保持水缸中無(wú)剩余殘餌。每天投飼前換水約30%，連續(xù)充氧，暫養(yǎng)2周后進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)，試驗(yàn)時(shí)間為8周，試驗(yàn)水為自然曝氣的自來(lái)水，試驗(yàn)期間水溫控制在20～25℃，pH為6.9～7.6，溶解氧含量為5～6 mg/L，氨氮含量0.15～0.20 mg/L。養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后禁食2 d稱(chēng)重，并采集試驗(yàn)樣品。

1.3 樣品采集

每個(gè)缸隨機(jī)取8尾魚(yú)，抽取血液后將血液冷凍離心（3 500 r/min）10 min后取上層血清備用，然后進(jìn)行解剖，分離出腸道和肝胰臟，將腸道、肝胰臟組織稱(chēng)重，在冰盤(pán)上剔除脂肪及內(nèi)容物，以10倍生理鹽水勻漿，將組織懸液冷凍離心(3 000 r/min)，上清液為粗酶提取物，于4℃冰箱中備用。

1.4 草魚(yú)生長(zhǎng)指標(biāo)和形體指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)過(guò)程中記錄飼料消耗量，根據(jù)終末體重和初始體重分別計(jì)算特定生長(zhǎng)率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)和蛋白質(zhì)效率(PER)等指標(biāo)。

SGR(%/d)=100×(lnFBW-lnIBW)/t

FCR(%)=FI/(FBW+DBW-IBW)

PER(%)=(FBW-IBW)×100/(FI×PC)

存活率 SR(%)=Nt×100/N0

其中IBW為初始體重，F(xiàn)BW為終末體重，DBW為死亡魚(yú)重，F(xiàn)I為攝食量，PC為蛋白質(zhì)含量，N0和Nt分別為初始尾數(shù)和終末尾數(shù)。

1.5 草魚(yú)非特異性免疫指標(biāo)的測(cè)定

非特異性免疫指標(biāo)中，分別測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)和堿性磷酸酶(AKP)活性；血液冷凍離心（3 500 r/min）10 min后取中間層備用；將肝胰臟于10倍魚(yú)用生理鹽水中勻漿，冷凍離心(10 000 r/min)10 min后取中間澄清部分測(cè)定酶活，置于4℃冰箱中備測(cè)。SOD活力采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定；AKP活力采用對(duì)硝基苯磷酸鹽法(試劑盒均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所)。

1.6 草魚(yú)消化酶活力的測(cè)定

蛋白酶活力采用福林-酚試劑 (Folin-phenol)法測(cè)定，酶單位活力定義為在pH 7.5，酪蛋白濃度為0.5%，37℃下每min水解酪素產(chǎn)生1 g酪氨酸為一個(gè)酶活力單位[8]。

淀粉酶活力采用碘-淀粉比色法，每mg蛋白在37℃與底物反應(yīng)30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活力單位。

脂肪酶活力測(cè)定脂肪酶活性測(cè)定參照聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法進(jìn)行；1 g組織中的脂肪酶1 min催化脂肪水解產(chǎn)生1 μmol脂肪酸的酶量定為一個(gè)活力單位[8]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差 (M±SD)表示，分析采用SPSS16.0 for Windows統(tǒng)計(jì)分析軟件，做單因素方差分析(One way-ANOVA)，若有顯著差異后再做組間Duncan’s多重比較，顯著性水平P為0.05。

2 結(jié)果

2.1 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

從表2可以看出，全植物蛋白飼料中添加植酸酶對(duì)草魚(yú)的SGR、FCR和PER有一定的影響。當(dāng)植酸酶添加水平大于1 000 U/kg(S3)時(shí)，其SGR和PER明顯大于D2、FCR則顯著低于D2(P<0.05)，但其SGR和PER顯著低于D1，F(xiàn)CR則明顯高于D1(P<0.05)。當(dāng)植酸酶含量小于1 000 U/kg時(shí)，試驗(yàn)組的SGR、FCR和PER與D2之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。各組之間存活率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表2 各飼料組草魚(yú)的特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)、蛋白質(zhì)利用率和存活率Tab.2 Specific growth rate,feed conversion ratio,protein efficiency ratio and survival ratio of grass carp fed on experimental diets

2.2 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對(duì)草魚(yú)非特異性免疫機(jī)能的影響

表3中D1的血清SOD活性顯著高于其它各組(P<0.05)，D2與其他各組之間有顯著性差異(P<0.05)；各組之間血清AKP活性沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。S4的肝胰臟SOD活性顯著高于D1和D2；各組之間肝胰臟AKP活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表3 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對(duì)草魚(yú)非特異性免疫機(jī)能的影響Tab.3 Effects of plant based diets containing different levels of phytase on non-immune of grass carp

2.3 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對(duì)草魚(yú)消化酶活性的影響

從表4可以看出，當(dāng)植酸酶添加水平大于1 000 U/kg時(shí)，草魚(yú)肝胰臟中的蛋白酶活性明顯增強(qiáng)，酶活大于其它各組 (P<0.05)；D1、D2和S1之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，S2顯著大于2個(gè)對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異；當(dāng)植酸酶活性大于750 U/kg時(shí)，各組之間蛋白酶活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但顯著大于D1、D2和S1；S1的腸道蛋白酶活性最低，且與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)；對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

當(dāng)植酸酶添加水平大于1 250 U/kg時(shí)，肝胰臟中的淀粉酶活性顯著大于D1、D2及S1(P<0.05)，與S2和S3之間無(wú)顯著性差異 (P>0.05)；D1的肝胰臟淀粉酶活性最低，與D2、S1及S2之間無(wú)顯著性差異 (P>0.05)；腸道中S3的淀粉酶活性最高，且與D1、D2和S1之間有顯著性差異(P<0.05)，試驗(yàn)組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，對(duì)照組的酶活最低，S5與對(duì)照組之間有顯著性差異(P<0.05)，但S1、S2及S4與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，對(duì)照組之間也無(wú)顯著性差異(P<0.05)。

當(dāng)植酸酶添加水平為大于1 000 U/kg時(shí)，其肝胰臟脂肪酶活性顯著大于對(duì)照組和S1(P<0.05)，與S2之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但大于S2；D2的酶活最低，與D1、S1之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；腸道脂肪酶活性中，S1的酶活最低，并與S3、S4、S5之間有顯著性差異(P<0.05)，S3的酶活最高，與S1、D1之間有顯著性差異(P<0.05)，與其他各組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表4 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對(duì)草魚(yú)消化酶活性的影響Tab.4 Effects of plant based diets containing different levels of phytase on digestive enzyme activities of grass carp

3 討論

3.1 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)的影響

本試驗(yàn)中，添加無(wú)機(jī)磷組的蛋白質(zhì)效率最高、飼料系數(shù)最低，且與其它各組有明顯差異（P<0.05），說(shuō)明磷對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能的提高十分重要。有研究表明，在飼料中添加植酸酶可以提高奧尼羅非魚(yú)Oreochromis aureus♂×Oreochromis niloticus♀[4]、點(diǎn)帶石斑魚(yú) Epinephelus coioides[9]、尼羅羅非魚(yú) Oreochromis niloticus[10]等的平均日增重和蛋白質(zhì)效率，降低餌料系數(shù)和死亡率。但也有研究發(fā)現(xiàn)植酸酶對(duì)韓國(guó)石斑魚(yú)[11]、大西洋鮭Salmo salar[12]等的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。劉曉俠等[13]研究表明，添加1 000 U/kg植酸酶能夠有效降低鯽魚(yú)Carassius auratus餌料系數(shù)；呂林蘭等[14]研究也發(fā)現(xiàn)飼料中植酸酶添加量1 000 U/kg為時(shí)，異育銀鯽Carassius auratus gibelio的平均增重率最大(P<0.05)，這些研究雖然植酸酶添加量相同，但彼此的基礎(chǔ)配方、魚(yú)種、植酸酶質(zhì)量與種類(lèi)、試驗(yàn)條件等之間的差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大影響，本試驗(yàn)中添加的是酸性植酸酶，且當(dāng)添加植酸酶的添加水平大于1 000 U/kg時(shí)，飼料系數(shù)顯著低于對(duì)照組2（D2），蛋白質(zhì)效率顯著提高，說(shuō)明在添加植酸酶后，草魚(yú)的生長(zhǎng)性能得到提高。這可能是在添加植酸酶后部分植酸磷得到釋放或有些消化酶被從螯合狀態(tài)中釋放出來(lái)從而提高魚(yú)體的生長(zhǎng)，從表2可以看出對(duì)照組1（D1）的總磷含量遠(yuǎn)大于其它各組，這可能是由于魚(yú)類(lèi)在利用磷時(shí)通常先利用易于利用的無(wú)機(jī)磷，當(dāng)無(wú)機(jī)磷不足時(shí)，植酸酶的作用才得以體現(xiàn)。本試驗(yàn)中，隨著植酸酶添加量的增加草魚(yú)的飼料系數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)、蛋白質(zhì)效率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且當(dāng)添加植酸酶的添加水平大于1 000 U/kg時(shí)，草魚(yú)飼料系數(shù)較D2顯著降低（P<0.05）。

3.2 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對(duì)草魚(yú)非特異性免疫的影響

植酸酶可與蛋白質(zhì)等物質(zhì)形成絡(luò)合物，影響某些酶和蛋白質(zhì)的功能和活性，從而對(duì)魚(yú)的免疫產(chǎn)生一定的影響。AKP是一種膜結(jié)合蛋白，與維持體內(nèi)鈣磷比有關(guān)，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，血清AKP活性升高[15]。鄭濤等[7]研究表明，無(wú)魚(yú)粉飼料中添加植酸酶和磷酸二氫鈣有助于降低AKP活性。但本試驗(yàn)結(jié)果表明，植酸酶對(duì)血清和肝胰臟AKP活性則無(wú)顯著性影響，這可能是不同的試驗(yàn)魚(yú)和試驗(yàn)條件產(chǎn)生不同的試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)，在家禽方面也對(duì)血清AKP活性有研究，封偉賢等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在豬飼料中添加酸性植酸酶對(duì)豬血清的AKP活性無(wú)顯著性差異，此結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似。

SOD是重要的抗氧化酶之一，在消除自由基、防生物分子損傷方面有十分重要的作用，是保護(hù)機(jī)體免受傷害的一種關(guān)鍵酶，其活性與生物的免疫水平密切相關(guān)[15]，植酸酶對(duì)魚(yú)類(lèi)SOD活性的影響還未見(jiàn)報(bào)道。從表3可以看出，雖然試驗(yàn)組血清SOD活性比添加無(wú)機(jī)磷(D1)組小，但與D2相比，植酸酶對(duì)草魚(yú)血清和肝胰臟中SOD活性有一定的提高作用，且當(dāng)植酸酶含量大于1 000 U/kg時(shí)其作用比較明顯，從而說(shuō)明當(dāng)植酸酶含量大于1 000 U/kg時(shí)，植酸酶對(duì)提高草魚(yú)血清及肝胰臟SOD活性有一定的作用，從而有助于草魚(yú)非特異性免疫功能的提高。

3.3 全植物蛋白飼料中添加植酸酶對(duì)草魚(yú)消化酶活性的影響

魚(yú)類(lèi)消化酶活性是反映其消化性能機(jī)理的一項(xiàng)重要指標(biāo)，植酸的絡(luò)合性影響了魚(yú)類(lèi)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，YOON報(bào)道，飼料中的植酸可以降低動(dòng)物對(duì)淀粉的消化率，NYMAN研究表明，大鼠日糧中添加植酸鈉時(shí)脂肪的消化率有所降低[3]。宋金彩等[17]研究表明，植酸酶可將與植酸絡(luò)合的蛋白質(zhì)釋放出來(lái)，便于消化道分泌的各種蛋白酶作用，同時(shí)植酸酶的添加可以解除植酸與內(nèi)源性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶結(jié)合，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率。朱麗英等[18]研究表明植酸酶能夠提高異育銀鯽的肝胰臟蛋白酶和脂肪酶，但淀粉酶活性降低，腸道脂肪酶活性增強(qiáng)，但蛋白酶和淀粉酶相對(duì)對(duì)照組較低。姚瑞清等[19]研究發(fā)現(xiàn)1 000 U/kg植酸酶顯著提高了奧尼羅非魚(yú)腸道蛋白酶與淀粉酶活性。張璐等[20]研究表明，飼料中添加植酸酶對(duì)鱸魚(yú)Lateolabrax japonicus胃和腸道中的脂肪酶和淀粉酶的活性無(wú)顯著影響，但是顯著提高了其胃和腸道中蛋白酶的活性，在本試驗(yàn)中，當(dāng)植酸酶添加添加水平大于1 000 U/kg時(shí)，草魚(yú)肝胰臟及腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性都顯著提高。植酸酶對(duì)草魚(yú)肝胰臟和腸道消化酶活性有提高作用，其原因可能是在低pH時(shí)，植酸可與蛋白質(zhì)分子的堿性基團(tuán)結(jié)合，抑制消化酶的活性，而植酸酶可以釋放與其結(jié)合的消化酶，從而提高消化酶的活性[14]；同時(shí)，磷的吸收量會(huì)影響?hù)~(yú)體內(nèi)能量的代謝從而影響?hù)~(yú)類(lèi)消化酶的代謝過(guò)程。

4 結(jié)論

試驗(yàn)表明，全植物蛋白飼料中添加植酸酶能夠提高草魚(yú)的特定生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)效率、降低飼料系數(shù)，有助于增強(qiáng)草魚(yú)的非特異性免疫機(jī)能，并有效提高草魚(yú)肝胰臟和腸道中的消化酶活性。在本試驗(yàn)條件下，植酸酶適宜添加量為1 000～1 250 U/kg。

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