賈保祥 馬威然 田 野

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院泌尿科，北京 100050)

人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)配型是器官移植患者術(shù)前選擇最佳移植供者的重要檢測之一，而腎移植術(shù)后群體反應(yīng)性抗體(panel reactive antibody，PRA)檢測則是鑒別移植物發(fā)生排斥反應(yīng)的重要監(jiān)測項目之一。血肌酐也是判斷腎移植術(shù)后移植腎功能的重要指標(biāo)之一。目前，在移植腎源極其匱乏的情況下，了解親屬腎移植供受者HLA配型的配合率的多寡和PRA抗體在親屬腎移植術(shù)后產(chǎn)生的概率，對預(yù)測移植腎的長期存活具有一定的臨床意義。因此本文對親屬腎移植受者腎移植術(shù)后1～4的HLA配型、PRA產(chǎn)生概率和腎功能變化進(jìn)行了追蹤研究，報告如下。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象

研究對象為2006年4月至2009年12月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院進(jìn)行親屬腎移植的336例患者，其中男性245例，女性91例，最大年齡58歲，最小年齡10歲。將患者分為5組:第1組為接受父母移植腎的患者118例，其中男性96例，女性22例。第2組為接受子女移植腎的患者12例，其中男性5例，女性7例。第3組為接受兄弟姐妹移植腎的患者107例，其中男性76例，女性31例。第4組為接受其他親屬移植腎的患者92例，其中男性64例，女性28例。第5組為夫妻間腎移植的患者7例，其中男性4例，女性3例。

親屬腎移植供者年齡最大67歲，最小21歲。其中第1組的供者中男性患者51例，女性67例。第2組的供者中男性10例，女性2例。第3組的供者中男性71例，女性36例。第4組供者中男性77例，女性15例。第5組供者中男性3例，女性4例。

1.2 試驗方法

1.2.1 HLA 分型

采用美國萊姆德公司和美國GTI公司提供的低分辨SSP-HLA-Ⅰ類、Ⅱ類分型試劑。操作步驟如下:1)提取DNA:① 取 EDTA抗凝血2 mL，3 000 r/min離心5 min。②吸取白細(xì)胞層，加入紅細(xì)胞裂解液8～10 mL，混勻。③3 200 r/min離心8 min。④ 棄上清，加入白細(xì)胞裂解液 2 mL、10%SDS 60 μL、5 mol/L 的高氯酸鈉500 μL、飽和氯化鈉 1 mL，充分混勻。⑤ 2 600 r/min離心15 min。⑥小心吸取上清加入到4 mL異丙醇中，待 DNA析出，用70%乙醇洗2～3次。⑦ 待DNA干燥后加入400～600μL蒸餾水，溶解DNA備用。2)擴(kuò)增:① 每人份取D-Mix 1管，加入Taq酶7μL(5 U/μL)、DNA 111 μL，充分混勻。② 點入96 孔板，每孔10μL。③置入PCR儀擴(kuò)增，擴(kuò)增條件:96℃ 130 s，63℃ 60 s，1 個循環(huán)，96 ℃ 10 s，63 ℃ 60 s，9 個循環(huán)，96 ℃10 s，59 ℃ 50 s，72 ℃ 30 s，20 個循環(huán)，4 ℃結(jié)束。3)電泳:①用TBE緩沖液配制2.5%瓊脂糖凝膠。②將擴(kuò)增產(chǎn)物移至凝膠中進(jìn)行電泳，150 V 3～4 min。③紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.2 PRA 檢測

采用美國萊姆德公司抗原篩選板和美國GTI公司提供的ELISA篩選HLA-Ⅰ類、Ⅱ類混合抗原板。鑒定抗體類型采用采用美國萊姆德公司鑒定抗原板(LAT-1240)，其抗原板包含21種HLA-A抗原特異性，29種HLA-B抗原特異性，15種HLA-Cw抗原特異性，14種HLA-DR抗原特異性，7種HLA-DQ抗原特異性。操作步驟按說明書。

1.2.3 血肌酐/尿素氮檢測

血肌酐/尿素氮檢測數(shù)據(jù)由檢驗科提供，由于腎移植患者術(shù)后導(dǎo)致腎功能下降的因素較多，故把血肌酐正常值115 μmol/L，尿素氮正常值7.14 mmol/L 提至血肌酐正常值130 μmol/L，尿素氮正常值8 mmol/L，以此調(diào)整腎移植術(shù)后患者調(diào)理不當(dāng)引起的腎功能不正常。凡患者腎移植術(shù)后血肌酐、尿素氮值分別高于130 μmol/L和8 mmol/L，均認(rèn)為移植腎功能下降。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腎移植患者術(shù)后腎功能變化及 PRA的產(chǎn)生

1)父母給子女供腎組:118例接受父母移植腎的患者中，有36例患者腎功能下降，占30.51%(36/118);8例為 PRA 陽性，占6.78%(8/118)，其中3例為 HLA-Ⅰ+Ⅱ抗體陽性，5例為HLA-Ⅱ抗體陽性，詳見表1。

2)子女給父母供腎組:12例接受子女移植腎的患者中僅1例腎功能下降，且為再次腎移植患者。12例患者PRA均陰性，詳見表1。

3)兄弟姐妹間供腎組:107例接受兄弟姐妹移植腎的患者中13例患者腎功能下降，占12.15%(13/107);3例PRA陽性，占2.80%(3/107)，其中1例Ⅰ+Ⅱ類抗體陽性，2例HLA-Ⅱ類抗體陽性。由此可見，接受兄弟姐妹移植腎的患者PRA產(chǎn)生的概率較低，而且功能下降者也少，詳見表1。

4)其他親屬供腎組:92例接受其他親屬移植腎的患者中有11例患者腎功能下降，占11.96%(11/96);6例患者PRA陽性，占6.52%(6/92)，其中2例為HLA-Ⅰ+Ⅱ類抗體陽性，4例為HLA-Ⅱ類抗體陽性，詳見表1。

5)夫妻間供腎組:7例接受夫妻間移植腎的患者HLA配型中均未有HLA-B抗原配合，其中有2例患者腎功能下降，且為PRA陽性，占28.57%(2/7);1例為HLA-Ⅰ類抗體陽性，1例為HLA-Ⅱ類抗體陽性，詳見表1。

表1 親屬腎移植患者HLA配型與腎功能的變化及PRA的產(chǎn)生Tab.1 HLA-typing and panel reactive antibody(PRA)with posttransplant renal function in related living donor renal transplantation

2.2 各組腎移植患者HLA配型及直系親屬與其他親屬抗原半相合比較

1)各組腎移植患者HLA配型:第1組的118例腎移植供受者HLA-A、B、DR、DQ抗原單體型半相合，其中有22例抗原配合率高于單體型半相合。第2組的12例腎移植供受者HLA-A、B、DR、DQ抗原單體型半相合，其中有7例HLA抗原配合率高于單體型半相合。第3組的107例兄弟姐妹間HLA-A、B、DR、DQ配型完全相配合有18例，73例為單體型半相合或大于單體型半相合，其余為低于單體型半相合或不相合。第4組的92例其他親屬移植的供受者間HLAA、B、DR、DQ等于或大于單體型半相合的有24例，完全不相合的有9例，雖然HLA抗原配合率大于4個抗原，但并不是單體型半相合抗原的有8例，等于或小于3個抗原配合的有51例。第5組的7例夫妻間移植患者，HLA配合率均≤3個抗原。

2)直系親屬與其他親屬抗原半相合比較:在直系親屬如接受父母、子女及兄弟姐妹供腎的237例患者中分別有118例、12例及91例患者的HLA-A、B、DR、DQ抗原單體完全相配合和半相合或大于半相合，占93.25%(221/237)。

92例接受其他活體移植腎的患者中HLA-A、B、DR、DQ等于或大于半相合的有24例，占26.07%(24/92)。直系親屬與其他親屬抗原半相合比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.000 1)。

3 討論

目前，在尸體腎移植腎源極其匱乏的情況下，親屬腎移植是移植腎的首選腎源。親屬活體腎移植具有非活體腎移植不可替代的諸多優(yōu)勢，如可提高HLA配型和手術(shù)成功率，縮短患者等待腎源的時間，手術(shù)時機(jī)可選擇，供腎質(zhì)量提高等。因此，了解親屬腎移植供受者HLA配型配合率的多寡，對預(yù)測移植腎的長期存活具有一定的臨床意義。HLA配型是器官移植術(shù)術(shù)前檢測項目中最重要的檢測之一，HLA配型在腎移植術(shù)中的應(yīng)用對提高移植腎的長期存活率及對抗HLA抗體高敏感的患者的腎移植具有重要意義。良好的HLA配型是維持移植器官長期存活的必備因素之一。進(jìn)行活體腎移植術(shù)能夠在親屬中選擇更加適宜的供體，降低了腎移植術(shù)后急性排斥的發(fā)生率，提高了人/腎存活率，還可降低免疫抑制劑用量，降低了藥物毒性反應(yīng)的發(fā)生，同時節(jié)省了患者的費用。

腎移植供受者HLA配合率高，可降低抗HLA抗體的生成。群體反應(yīng)性抗體(PRA)的產(chǎn)生是導(dǎo)致腎移植術(shù)后發(fā)生排斥的重要因素之一，PRA的產(chǎn)生主要由術(shù)前輸血、婦女妊娠和再次移植前的移植物刺激所致。PRA的存在與急慢性排斥反應(yīng)，急性血管排斥反應(yīng)的發(fā)生均有關(guān)系。PRA水平越高，意味著其預(yù)致敏程度越高，移植后發(fā)生排斥反應(yīng)的概率越高;相應(yīng)的此受者等待供受者之間淋巴毒交叉配型陰性的腎移植的概率也越少。Singh D等［1］分析了406例抗體高敏感的患者術(shù)前抗HLA抗體與術(shù)后排斥反應(yīng)發(fā)生率的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，術(shù)前PRA顯著下降的患者移植腎存活率顯著高于術(shù)前PRA保持峰值水平者。其中術(shù)前PRA＜26%且峰值PRA與術(shù)前PRA之差＞37%者預(yù)后最好。

由本研究結(jié)果可見，即使在親屬及兄弟姐妹間HLA抗原達(dá)到完全配合的也較少。良好的HLA配型不僅可明顯減少排斥反應(yīng)的發(fā)生而且可以提高移植腎的長期存活率。由于HLA基因的多態(tài)性，對于實體腎移植，獲得良好的配型勢必要增加患者術(shù)前等待時間，而存在血緣關(guān)系的親屬供腎可有效解決這一問題［2］。HLA錯配在初次和再次的尸體腎移植可降低移植腎存活率，而在親屬腎移植中患者HLA錯配的存活率則基本相同［3］。因此親屬間的器官移植可縮短移植受者等待移植器官的時間，而且可得到非親屬腎移植供受者間不易得到的HLA配合率。HLA配合率的降低，更容易在腎移植術(shù)后產(chǎn)生抗供者特異性抗體，從而導(dǎo)致抗體介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。

Li X等［4］研究了87例活體腎移植患者，供者特異性抗體陽性的患者有80%出現(xiàn)了排異癥狀。術(shù)后出現(xiàn)抗體的患者，其5年腎存活率為69%，而術(shù)前術(shù)后抗體均為陰性的患者，5年腎存活率為96%，術(shù)前陽性術(shù)后陰性的患者，5年腎存活率88%，術(shù)前術(shù)后抗體均陽性的患者，5年腎存活率為93%。因此認(rèn)為腎移植患者若在術(shù)后產(chǎn)生了新的抗體，尤其是供者特異性抗體(盡管術(shù)前PRA陰性)，其發(fā)生排異的概率較高。因此術(shù)后及時監(jiān)測HLA抗體具有重要意義。袁小鵬等［5］對腎移植術(shù)后1～14 d發(fā)生抗體介導(dǎo)的急性排斥(AMR)反應(yīng)的患者進(jìn)行抗供者特異性抗體的檢測，發(fā)現(xiàn)15例患者中術(shù)后出現(xiàn)抗供者特異性HLA-Ⅰ類抗體的有9例，抗HLA-Ⅱ類抗體的有4例，同時出現(xiàn)抗HLA-Ⅰ和Ⅱ類抗體的患者2例。經(jīng)抗排斥治療后14例患者逆轉(zhuǎn)，1例患者術(shù)后10 d切除移植腎。15例患者的供受者HLA配型均有不同程度的HLA錯配，故而產(chǎn)生抗供者特異性抗體，加大了急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率?？梢娏己玫腍LA配合的重要性在于，可避免產(chǎn)生抗供者特異性抗體，降低移植腎的急性排斥發(fā)生率。同時，對于再次移植的患者，HLA供受者間的配合率尤其顯得更重要，因為在再移植的受者中，抗HLA抗體生成的概率比腎移植術(shù)前輸血者高很多，二者間有非常大的差異［6］。同時HLA的錯配可增加再次腎移植受者的致敏性，初次腎移植接受HLA-A，-B，-DR抗原零錯配或 HLA-A，-B抗原零錯配的患者PRA沒有變化。然而，在初次腎移植HLA錯配數(shù)越多，則PRA的增加越顯著。HLA-A，-B抗原零錯配的移植受者僅10%成為致敏者，而增加HLA錯配則致敏率則可高達(dá)37%［7］。由此可見，親屬腎移植在HLA配型中具有特殊的優(yōu)勢，其HLA錯配率可大大低于非親屬腎移植患者。

在本研究中可見，92例其他親屬腎移植的患者中，供受者間HLA-A、B、DR、DQ等于或大于單體型半相合的有24例;完全不相合的有9例;雖然HLA抗原配合率大于4個抗原，但并不是單體型半相合抗原的有8例;等于或小于3個抗原配合的有51例。經(jīng)過直系親屬與其他親屬HLA-A、B、DR、DQ單體型半相合比較，兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見，非直系親屬HLA的配合率低于直系親屬。而從另一方面證實HLA的配合率在人群中達(dá)到完全配合實屬不易，這是由于HLA的多態(tài)性所致。在親屬活體腎移植者中，對其近期腎功能和PRA的檢查中發(fā)現(xiàn)，移植腎功能下降和PRA陽性在親屬間發(fā)生的概率均較低，由本研究結(jié)果可見，接受父母移植腎患者可能由于供者年齡較高，導(dǎo)致移植腎功能下降，但PRA產(chǎn)生的概率則較低。而接受兄弟姐妹間移植腎的患者PRA產(chǎn)生的概率同樣較低，且移植腎功能下降者也少。而在接受其他親屬移植腎的患者中，同樣表現(xiàn)出基本相似的結(jié)果。由此可見，HLA配型在移植腎短期存活中并沒有其必然優(yōu)勢，而供者的年齡則是影響移植腎功能的重要因素之一。而腎移植術(shù)后PRA生成的概率較低與腎移植供受者HLA的配型具有一定的關(guān)系。因此，選擇HLA配型理想、PRA陰性的供受者是提高移植腎長期存活率的關(guān)鍵，可杜絕移植腎的超急性排斥反應(yīng)，并減少急性排斥的發(fā)生率。

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