梅雪嶺 連 石

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院皮膚科，北京 100050;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院皮膚科，北京 100053)

人體干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。目前在人體多種組織中發(fā)現(xiàn)了組織特異性的成體干細(xì)胞，包括造血系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、角膜上皮等。成體干細(xì)胞有2種特性，自我更新能力和多潛能性。干細(xì)胞能夠不對(duì)稱性分裂產(chǎn)生一個(gè)干細(xì)胞存留在龕內(nèi)和另一個(gè)短暫擴(kuò)充細(xì)胞經(jīng)歷有限的增生和終末分化［1］。表皮是皮膚外層的復(fù)層上皮，包括濾泡間上皮和附屬結(jié)構(gòu)(毛囊和皮脂腺)。在整個(gè)生命過(guò)程中，表皮內(nèi)的終末分化細(xì)胞不斷地脫落并被替代。表皮內(nèi)的終末分化細(xì)胞不能分裂，它們的替代依賴于表皮干細(xì)胞。表皮干細(xì)胞通過(guò)對(duì)稱或不對(duì)稱的分裂而產(chǎn)生短暫擴(kuò)充細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生濾泡間上皮、毛囊和皮脂腺。最具特征性的表皮干細(xì)胞群位于毛囊的隆突處，但是濾泡間上皮和皮脂腺內(nèi)也存在表皮干細(xì)胞［2］。表皮干細(xì)胞具有自我更新和多潛能性，因此其主要作用是維持正常狀態(tài)下的表皮的動(dòng)態(tài)平衡。此外，這些低分裂傾向的休眠的干細(xì)胞，在創(chuàng)傷后能夠廣泛并且持續(xù)的自我更新從而促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，因此表皮干細(xì)胞是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的潛在的細(xì)胞來(lái)源。除了維持表皮的平衡和愈合，表皮干細(xì)胞還是腫瘤發(fā)生和基因治療的重要靶點(diǎn)［3］?；诒砥じ杉?xì)胞在創(chuàng)傷愈合與腫瘤研究方面的重要作用，對(duì)于表皮干細(xì)胞的研究意義重大。

關(guān)于人表皮干細(xì)胞的分離和鑒定已經(jīng)有相關(guān)的研究。在早期的研究［4］中，通常根據(jù)表皮干細(xì)胞在體外的增生潛能與其他角質(zhì)形成細(xì)胞不同而利用克隆類型來(lái)鑒別表皮干細(xì)胞，但是操作難度較大。近期的研究［5］發(fā)現(xiàn)了一些表皮干細(xì)胞高表達(dá)的蛋白分子，如整合素、P63蛋白、角蛋白15、19等。利用這些分子標(biāo)志物鑒別表皮干細(xì)胞易于操作。本研究依據(jù)表皮干細(xì)胞能夠快速黏附細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的特性分離了快速黏附Ⅳ型膠原的原代角質(zhì)形成細(xì)胞群并且通過(guò)檢測(cè)α1整合素、P63蛋白分子的表達(dá)對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

1)儀器:CO2孵箱為美國(guó)Thermo Forma公司產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品;共聚焦顯微鏡為德國(guó)萊卡公司產(chǎn)品。

2)試劑:中性蛋白酶II為德國(guó)羅氏公司產(chǎn)品;胰蛋白酶/EDTA，蛋白酶抑制劑，EpiLife培養(yǎng)基均為美國(guó)Cascade Biologics公司產(chǎn)品;Ⅳ型膠原為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;鼠抗人p63抗體(Sc-8431)，鼠抗人α6-整合素抗體(Sc-71427)均為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品;TFITC結(jié)合的羊抗鼠熒光抗體(ZF-0313)為美國(guó)ZSGB-BIO公司產(chǎn)品。DAPI為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1)正常原代角質(zhì)形成細(xì)胞的分離和培養(yǎng):正常人皮膚標(biāo)本來(lái)源于包皮環(huán)切術(shù)的患者(年齡≤20歲)。依據(jù)之前的研究方法［6］制備原代的角質(zhì)形成細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，將皮膚標(biāo)本置于2.4 U/mL中性蛋白酶Ⅱ中4℃過(guò)夜使表皮與真皮分離。將表皮片置于胰蛋白酶/EDTA中37℃作用30 min并用蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)。將反應(yīng)的產(chǎn)物置于EpiLife培養(yǎng)基中制備人正常原代角質(zhì)形成細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液種于無(wú)Ⅳ型膠原包被的普通24孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃培養(yǎng)箱，EpiLife培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)正常原代角質(zhì)形成細(xì)胞。

2)快速黏附Ⅳ型膠原的角質(zhì)形成細(xì)胞的分離和培養(yǎng):快速黏附Ⅳ型膠原的角質(zhì)形成細(xì)胞的制備過(guò)程在之前的研究［7］中已經(jīng)描述。將人的原代角質(zhì)形成細(xì)胞的單細(xì)胞懸液種于用20 μg/mLⅣ型膠原包被的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。之后，用培養(yǎng)基清洗培養(yǎng)板2次，將培養(yǎng)板內(nèi)沒(méi)有黏附的細(xì)胞全部去掉，剩余的即為快速黏附Ⅳ型膠原的角質(zhì)形成細(xì)胞。將此細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱，EpiLife培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。將2種細(xì)胞群置于相同的條件下培養(yǎng)，EpiLife培養(yǎng)基，5%CO237℃培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞形態(tài)。

3)快速黏附Ⅳ型膠原的角質(zhì)形成細(xì)胞和正常原代角質(zhì)形成細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記:細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將快速黏附Ⅳ型膠原的角質(zhì)形成細(xì)胞和原代正常角質(zhì)形成細(xì)胞在相同的條件下進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記:4%多聚甲醛室溫下固定10 min;磷酸鹽緩沖液洗滌3遍;穿孔劑室溫下作用15 min;2%牛血清蛋白封閉30 min;洗滌后分別加入p63、α6-整合素抗體4℃過(guò)夜。2種抗體均按1∶100比例稀釋使用。過(guò)夜后將細(xì)胞清洗3遍，再將細(xì)胞與熒光素標(biāo)記的抗體37℃下作用1 h。DAPI室溫下復(fù)染5 min標(biāo)記細(xì)胞核。

4)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及量化分析:使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的大小形狀等形態(tài)特征并取得圖片。使用共聚焦顯微鏡觀察不同抗體標(biāo)記細(xì)胞的熒光反應(yīng)狀態(tài)并取得圖片。同時(shí)于2種細(xì)胞群的2種標(biāo)志物染色結(jié)果中各取得20個(gè)高倍視野，并計(jì)數(shù)p63，α6-整合素陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3遍。采用SAS 9.1.3軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，各組數(shù)據(jù)間的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞分離培養(yǎng)后24和48 h，所有的快速黏附細(xì)胞形態(tài)及大小幾乎一致，細(xì)胞核較大，細(xì)胞近似圓形。但是對(duì)照組的正常原代角質(zhì)形成細(xì)胞形狀不規(guī)則，大小不一致(圖1)。

2.2 細(xì)胞分子標(biāo)記蛋白的表達(dá)

于分離細(xì)胞后24 h，我們用α6整合素，p63抗體對(duì)2組細(xì)胞群進(jìn)行染色，并且利用共聚焦顯微鏡觀察2種蛋白的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，快速黏附于Ⅳ型膠原的角質(zhì)形成細(xì)胞群高表達(dá)α6整合素和p63蛋白。相反，對(duì)照組原代角質(zhì)形成細(xì)胞群低表達(dá)α6整合素和p63蛋白(圖2)。

2.3 量化分析

為了進(jìn)一步量化分析2組細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況，本研究選擇了20個(gè)高倍視野對(duì)α6整合素、p63蛋白表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并進(jìn)行比較(圖3)。2組細(xì)胞蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。此量化分析結(jié)果顯示快速黏附Ⅳ型膠原而分離的角質(zhì)形成細(xì)胞群富集了人的表皮干細(xì)胞。

3 討論

圖3 細(xì)胞標(biāo)記蛋白表達(dá)量化分析Fig.3 Quantitative analysis of expression of markers

表皮干細(xì)胞的生物學(xué)研究能夠?yàn)槟承┢つw病的臨床治療提供新的思路，如對(duì)于燒傷、難治性潰瘍以及一些遺傳異常導(dǎo)致的皮膚缺損性疾病，宿主表皮干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增能夠最大限度地減少患者供皮區(qū)的面積，給皮膚移植和皮膚替代物的研究帶來(lái)新的希望。除了皮膚替代物，表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)還提供了基因治療的可能性，此方法在大皰性表皮松解的動(dòng)物模型中已經(jīng)獲得成功［1］。表皮干細(xì)胞研究與臨床相關(guān)的另一個(gè)方面是皮膚的惡性腫瘤。在致癌物研究的模型中，致癌物被發(fā)現(xiàn)殘留在表皮內(nèi)的休眠的細(xì)胞內(nèi)和具有高增生潛力的細(xì)胞內(nèi)，均提示為表皮干細(xì)胞。所以，通過(guò)表皮干細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究的發(fā)展，我們也許能夠更好地治療良性和惡性的皮膚疾病。

分離并鑒定表皮干細(xì)胞是表皮干細(xì)胞體外研究的基礎(chǔ)。早期的研究［8］顯示，快速黏附于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的角質(zhì)形成細(xì)胞表現(xiàn)為高效的克隆形成，進(jìn)一步的研究［7］結(jié)果也顯示利用快速黏附Ⅳ型膠原，纖連蛋白或其他細(xì)胞外基質(zhì)的方法能夠從角質(zhì)形成細(xì)胞中純化干細(xì)胞。因此利用快速黏附Ⅳ型膠原的方法分離表皮干細(xì)胞的方法被普遍應(yīng)用。表皮干細(xì)胞的鑒定是近年來(lái)的研究重點(diǎn)，許多表皮干細(xì)胞標(biāo)記分子陸續(xù)被報(bào)道，整合素是介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞與基底膜黏附的黏附分子，β1整合素的表達(dá)局限于毛囊的隆突部位和表皮突，α6整合素表達(dá)于毛囊外根鞘的最外層和濾泡間上皮的基底層，2者均為表皮干細(xì)胞的標(biāo)記分子之一。研究［10］顯示角蛋白(cytokeratin，CK)-15陽(yáng)性細(xì)胞位于毛囊隆突部位，表皮的基底層和外分泌腺，也是表皮干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白之一。CK19陽(yáng)性的細(xì)胞也出現(xiàn)于毛囊隆突和遠(yuǎn)端外根鞘的外層，體內(nèi)和體外研究［11］均顯示CK19對(duì)于干細(xì)胞的定向分化很重要，亦為表皮干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白之一。轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)性關(guān)聯(lián)蛋白p63是p53腫瘤抑制基因的類似物，研究［5］顯示p63蛋白表達(dá)于基底層和毛囊外根鞘的細(xì)胞，可以作為鑒定表皮干細(xì)胞的標(biāo)記分子。研究［12］顯示CD34表達(dá)于人毛囊隆突下部外根鞘的外層細(xì)胞。CD200陽(yáng)性細(xì)胞也已經(jīng)從標(biāo)記滯留的人隆突細(xì)胞中分離出來(lái)，并且發(fā)現(xiàn)CD200可能在抑制免疫反應(yīng)中發(fā)揮了作用，能夠防止毛囊內(nèi)的角質(zhì)形成細(xì)胞的炎性反應(yīng)損害［13］。雖然研究顯示多種蛋白標(biāo)記分子表達(dá)于表皮干細(xì)胞分布的部位，但是唯一特異并且可靠的干細(xì)胞標(biāo)記分子仍舊缺乏。因此我們使用2種標(biāo)記分子聯(lián)合鑒定法來(lái)標(biāo)記分離的細(xì)胞。因?yàn)楸砥じ杉?xì)胞具有高黏附和高增生的特性，因此我們選取代表黏附和增生特性的整合素和P63蛋白分子作為標(biāo)記分子。

本研究利用快速黏附Ⅳ型膠原的方法分離了具有快速黏附能力的角質(zhì)形成細(xì)胞，并且對(duì)分離的細(xì)胞是否表達(dá)α6整合素、p63蛋白進(jìn)行鑒定。我們發(fā)現(xiàn)分離的快速黏附細(xì)胞形態(tài)與普通角質(zhì)形成細(xì)胞形態(tài)不同，細(xì)胞呈圓形，大小均勻一致，胞核較大。分離的快速黏附細(xì)胞高表達(dá)α6整合素和p63蛋白與傳統(tǒng)方法分離到的正常角質(zhì)形成細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明快速黏附法分離的細(xì)胞群具有顯著的高黏附和高增生的特性，均符合表皮干細(xì)胞的特性。雖然短暫擴(kuò)充細(xì)胞的特性與表皮干細(xì)胞的特性非常相似，而且目前尚無(wú)一種特異的蛋白分子能夠在體外將2者嚴(yán)格區(qū)分，但是快速黏附法分離的細(xì)胞群較正常角質(zhì)形成細(xì)胞群而言是富集了人表皮干細(xì)胞的細(xì)胞群。因此，利用此細(xì)胞群作為體外研究的研究對(duì)象獲得的研究結(jié)果能夠代表表皮干細(xì)胞的趨向性。

總之，我們利用表皮干細(xì)胞對(duì)膠原的黏附特性成功地從人的正常皮膚中分離出了富集了人表皮干細(xì)胞的細(xì)胞群并對(duì)其進(jìn)行鑒定。為進(jìn)一步體外研究表皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。

［1］Li L，Xie T.Stem cell niche:structure and function［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2005，21:605-631.

［2］Alonso L，F(xiàn)uchs E.The hair cycle［J］.J Cell Sci，2006，119(Pt3):391-393.

［3］Owens D M，Watt F M.Contribution of stem cells and differentiated cells to epidermal tumours［J］.Nat Rev Cancer，2003，3(6):444-3451.

［4］Barrandon Y，Green H.Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1987，84(8):2302-2306.

［5］Pellegrini G，Dellambra E，Golisano O，et al.P63 identi-fies keratinocyte stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98(6):3156-3161.

［6］Wittmann M，Purwar R，Hartmann C，et al.Human keratinocytes respond to interleukin-18:implication for the course of chronic inflammatory skin diseases［J］.J Invest Dermatol，2005，124(6):1225-1233.

［7］Kim D S，Cho H J，Choi H R，et al.Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents［J］.Cell Mol Life Sci，2004，61(21):2774-2781.

［8］Jones P H，Watt F M.Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression［J］.Cell，1993，73(4):713-724.

［9］Kloepper J E，Tiede S，Brinckmann J，et al.Immunophenotyping of the human bulge region:the quest to define useful in situ markers for human epithelial hair follicle stem cells and their niche［J］.Exp Dermatol，2008，17(7):592-609.

［10］Lyle S，Christofidou-Solomidou M，Liu Y，et al.The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells［J］.J Cell Sci，1998，111(Pt21):317931-317988.

［11］Michel M，Torok N，Godbout M J，et al.Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro:keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites，and their number varies with donor age and culture stage［J］.J Cell Sci，1996，109(Pt5):1017-1028.

［12］Trempus C S，Morris R J，Bortner C D，et al.Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34［J］.J Invest Dermatol，2003，120(4):501-511.

［13］Rosenblum M D，Olasz E B，Yancey K B，et al.Expression of CD200 on epithelial cells of the murine hair follicle:a role in tissuespecific immune tolerance?［J］.J Invest Dermatol，2004，123(5):880-887.