王 燕 李 萍 林 燕 趙京霞 劉 欣 何 薇 梁代英 羅曉琴 王笑民*
(1.北京市中醫(yī)研究所,北京 100010;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京 100010)
雞血藤(spatholobus suberectus dunn)黃酮類有效部位是養(yǎng)血活血類中藥,常用于腫瘤患者。研究[1-2]表明,雞血藤提取物在體內(nèi)、體外試驗(yàn)中均呈現(xiàn)抗腫瘤作用。采用聚酰胺柱色譜法從雞血藤醇提取物中分離獲得的富含黃酮類化合物組分“雞血藤黃酮類有效部 位 (spatholobus suberectus column extract,SSCE)”,SSCE在體外試驗(yàn)中抑制腫瘤活性最強(qiáng)[3]。
本試驗(yàn)組選用敏感的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞株作為研究對(duì)象,觀察SSCE作用后細(xì)胞凋亡的情況及線粒體膜電位的改變,以探討雞血藤抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ),為尋找新的高效低毒的新型抗癌先導(dǎo)化合物提供依據(jù)。
恒溫CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司),SA1000酶標(biāo)儀(奧地利 Asyshitech公司),激光共聚焦顯微鏡FV500(日本Olympus公司)。
SSCE由北京市中醫(yī)研究所藥化室制備。F12培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司);胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司);細(xì)胞增生試劑盒cell counting kit-8(CCK-8,日本同仁化學(xué)公司),Annexin V-PI雙染試劑盒(Cat K 101-25,美國(guó)BioVision公司),Hoechst染料(日本同仁化學(xué)公司),JC-1染料(北京碧云天公司),Mitotracker Red(Cat PA-3017,瑞士Lonza公司)。
人肺腺癌A549細(xì)胞系購自協(xié)和細(xì)胞中心。細(xì)胞培養(yǎng)條件:F12培養(yǎng)基,含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素100 U/mL,鏈霉素100 mg/L),置于37℃、5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。
采用CCK-8檢測(cè),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,調(diào)細(xì)胞個(gè)數(shù)為2×107/L,接種于96孔板中,每孔100 μL,于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,吸出上清液,每孔加入100 μL含SSCE或無SSCE的培養(yǎng)液。
實(shí)驗(yàn)分為4組,分別為:①對(duì)照組:A549細(xì)胞+完全F12培養(yǎng);②低劑量組:A549細(xì)胞+40 mg/L SSCE;③中劑量組:A549細(xì)胞+80 mg/L SSCE;④高劑量組:A549細(xì)胞+160 mg/L SSCE。每組至少設(shè)3個(gè)副孔,培養(yǎng)24、48、72 h 后,每孔加入 10 μL CCk-8 溶液,培養(yǎng) 4 h,在酶標(biāo)儀上測(cè)450 nm處吸光度A,并計(jì)算細(xì)胞增生抑制率(inhibition rate,IR),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
細(xì)胞增生抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A)×100%。
1)Annexin V-PI雙染法激光共聚焦顯微鏡觀察:細(xì)胞以1×105/mL傳送于Petri小皿中,分為對(duì)照組及SSCE 組(160 mg/L,作用24 h、48 h),用 PBS洗2次,分別加入 100 μL 1 × Binding Buffer緩沖液,5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI,室溫避光孵育 15 min,再加入400 μL 1×Binding Buffer緩沖液,激光共聚焦觀察。激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm;發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm。
2)Hoechst染色倒置熒光顯微鏡觀察:將細(xì)胞傳送于提前放置好潔凈蓋玻片的24孔板中,細(xì)胞密度1×105/mL,待細(xì)胞貼壁后,向孔內(nèi)加入SSCE(160 mg/L),同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組,SSCE作用24 h后,取出細(xì)胞爬片,于PBS溶液中漂洗3 min×3次,漂洗后于預(yù)冷的固定液中(甲醛與丙酮1∶1混合)固定細(xì)胞8 min,向固定好的細(xì)胞滴加 Hoechst33342(5 μmol/L 50 μL),37℃孵育15 min,取載玻片,每片上滴加1滴防熒光淬滅劑,將細(xì)胞片扣于載玻片上,于正置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核變化。
1)JC-1染色激光共聚焦顯微鏡觀察:細(xì)胞以1×105/mL傳送于Petri小皿中,分為對(duì)照組及SSCE組(160、80、40 mg/L,作用 24 h),用 PBS 洗 2 次,加入JC-1(50 mg/L,200 μL),37 ℃孵育 20 min,激光共聚焦顯微鏡觀察。JC-1是檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針,在線粒體膜電位較高時(shí),JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中,形成聚合物(J-aggregates),可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時(shí),JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,此時(shí)JC-1為單體(monomer),可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測(cè)線粒體膜電位的變化。
JC-1單體的最大激發(fā)波長(zhǎng)為514 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為529 nm;JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激發(fā)波長(zhǎng)為585 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm。實(shí)際觀察時(shí),使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。用軟件計(jì)算紅綠熒光比值。
2)Mitotracker Red染色激光共聚焦顯微鏡檢測(cè):細(xì)胞以1×105/mL傳送于Petri小皿中,分為對(duì)照組及SSCE組(160 mg/L,作用24 h),用 PBS洗2次,加入 Mitotracker(5 mg/L,200 μL),37 ℃孵育 20 min,激光共聚焦顯微鏡觀察。
數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間比較采用折因方差分析和均數(shù)的兩兩比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
相同處理時(shí)間不同濃度SSCE作用后,對(duì)細(xì)胞活性的影響與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,低、中、高3個(gè)劑量的 SSCE作用24 h后,抑制率分別為10.29%、31.52% 和42.75%;各劑量 SSCE 處理 48 h后,抑制率分別為 27.15%、38.85% 和 57.49%;各劑量 SSCE處理 72 h后,抑制率分別為 15.13%、15.10%和 37.52%,詳見表 1。
表1 不同濃度SSCE作用相同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞增生的影響Tab.1Effect of SSCE on the proliferation of A549 cells(±s)n=6
表1 不同濃度SSCE作用相同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞增生的影響Tab.1Effect of SSCE on the proliferation of A549 cells(±s)n=6
* P <0.05,** P <0.01 vs control;SSCE:spatholobus suberectus column extract;OD:optical density.In each group the time of reaction was the same,and the effects of different concentration of SSCE on cell proliferation were compared.
Group OD 24 h 48 h 72 h Control 0.639 ±0.011 2.280 ±0.190 3.299 ±0.231 160 mg/L 0.366 ±0.035** 0.969 ±0.107** 2.088 ±0.211**80 mg/L 0.438 ±0.056** 1.394 ±0.158* 2.837 ±0.102*40 mg/L 0.574 ±0.081* 1.661 ±0.791* 2.836 ±0.107*
磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè),但在細(xì)胞凋亡的早期,PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面,暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。發(fā)生PS外翻的細(xì)胞能夠結(jié)合AnnexinV-FITC呈綠色熒光圖像。凋亡晚期和死亡細(xì)胞能夠被PI染成紅色。因此,未被染色的為正常細(xì)胞,單染綠色熒光的為早期凋亡,紅綠雙染的為晚期凋亡,單染紅色的為死亡細(xì)胞。SSCE在濃度160 mg/L作用于A549細(xì)胞24 h后,細(xì)胞單染綠色(圖1B),表明發(fā)生了早期凋亡。作用48 h后,細(xì)胞呈紅綠雙染,表明為晚期凋亡(圖1D)。
圖1 SSCE作用24、48 h后Annexin V-PI染色激光共聚焦顯微鏡觀察PS外翻Fig.1 Immunofluorescence staining of Annexin V-PI in SSCE incubated A549 cells(600×)
在熒光顯微鏡下觀察,正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色,陽性對(duì)照組大量細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染(圖2A),而SSCE組在濃度160 mg/L作用24 h,部分細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染(圖2B)。
圖2 SSCE作用24 h后Hochest33342染色倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核Fig.2 Immunofluorescence staining of Hochest33342 in SSCE incubated A549 cells(100×)
SSCE作用于A549細(xì)胞24 h后,紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變,綠色熒光與紅色熒光比值升高,詳見表2,圖3。
正常細(xì)胞線粒體經(jīng)染色后,呈均勻的棒狀、顆粒狀(圖4A);SSCE作用于細(xì)胞24 h后,線粒體由顆粒狀、棒狀變?yōu)辄c(diǎn)狀,并向細(xì)胞核聚集(圖4B)。
表2 不同劑量SSCE作用A549細(xì)胞24 h后線粒體膜電位的改變Tab.2 Effect of SSCE on the mitochondrial membrane potential of A549 cells(±s)n=4
表2 不同劑量SSCE作用A549細(xì)胞24 h后線粒體膜電位的改變Tab.2 Effect of SSCE on the mitochondrial membrane potential of A549 cells(±s)n=4
** P <0.01 vs control;SSCE:spatholobus suberectus column extract.
SSCE Green fluorescence/Red fluorescence Control 0.557 ±0.082 160 mg/L 3.057 ±0.365**80 mg/L 2.426 ±0.440**40 mg/L 1.954 ±0.451**
圖3 SSCE作用24 h后JC-1染色激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體膜電位Fig.3 Immunofluorescence staining of JC-1 in SSCE incubated A549 cells(600×)
雞血藤是一味養(yǎng)血活血中藥,中醫(yī)古籍記載用于治療月經(jīng)不調(diào)、血虛萎黃、風(fēng)濕痹痛等癥,藥化分析發(fā)現(xiàn)其含有大量黃酮類化合物?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究[3]證實(shí)雞血藤具有刺激骨髓造血功效,近年來研究[3]發(fā)現(xiàn)雞血藤粗提物及其總黃酮組分在細(xì)胞水平和整體的動(dòng)物水平都表現(xiàn)出抗腫瘤活性,其中富含黃酮成分的有效部位SSCE在體外抑瘤作用最強(qiáng)。
人們一直以為細(xì)胞增生和分化的異常是腫瘤發(fā)生的主要原因,隨著對(duì)細(xì)胞凋亡概念的引入,人們開始從細(xì)胞凋亡的角度審視腫瘤的發(fā)生[4]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞對(duì)內(nèi)外刺激信號(hào)做出的應(yīng)答反應(yīng),在機(jī)體的許多生理、病理過程中都起到重要的作用。
圖4 SSCE作用24 h后Mitotracker red染色激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體形態(tài)Fig.4 Immunofluorescence staining of Mitotracker red in SSCE incubated A549 cells(600×)
線粒體不僅在細(xì)胞存活而且在細(xì)胞凋亡通路中起著核心作用。細(xì)胞凋亡過程中,線粒體形態(tài)和功能均發(fā)生顯著變化。線粒體跨膜電位的下降或線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。在致凋亡因子的刺激下,線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放,線粒體跨膜電位降低或喪失,線粒體基質(zhì)中釋放出凋亡蛋白使細(xì)胞凋亡。劉麗啟等[5]報(bào)道線粒體跨膜電位的耗散是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的時(shí)間,而一旦線粒體跨膜電位耗散,細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入不可逆的凋亡過程。
本研究前期實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀對(duì)PS及細(xì)胞周期進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)SSCE可以使細(xì)胞周期S期細(xì)胞增多,G0-G1和G2-M期細(xì)胞減少。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),SSCE作用于細(xì)胞24 h后,PS表現(xiàn)外翻、細(xì)胞質(zhì)固縮,線粒體由棒狀變成點(diǎn)狀,并向細(xì)胞核聚集,線粒體膜電位顯著下降,有明顯的凋亡特征;提示SSCE可能對(duì)線粒體凋亡通路發(fā)揮作用。
凋亡通路包括線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑,隨著細(xì)胞生物學(xué)研究的深入,新的細(xì)胞死亡途徑逐漸被揭示出來,如脹亡、自噬、副凋亡等[6]。在細(xì)胞程序性死亡過程中,各種通路不是單獨(dú)起作用的,而是相互交聯(lián)的,有彼此重疊的機(jī)制出現(xiàn)。因此,SSCE誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
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