吳 楊 蘇玉金 李 昕 劉光偉 李堯華 于 順*

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學研究室，教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100053;2.首都醫(yī)科大學天壇醫(yī)院神經(jīng)科學研究所，北京 100050)

α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)由 140 個氨基酸組成，在中樞及外周神經(jīng)組織中含量豐富，主要存在于成年人腦組織神經(jīng)元的突觸前終末端，與突觸可塑性的形成有關［1］。α-syn在胚胎腦組織主要存在于神經(jīng)元的胞體中，隨著胚胎發(fā)育，逐漸分布到突觸前終末端［2-3］。以往的研究［4-5］表明，α-syn 可以促進 β-微管蛋白組裝成微管，并提高培養(yǎng)的MES23.5多巴胺神經(jīng)細胞增生速度。鑒于α-syn家族中的另一個成員 γ-突觸核蛋白(γ-synuclein，γ-syn)也具有促進 β-微管蛋白組裝成微管的作用［6］，并影響腫瘤細胞的增生、遷移和侵襲性［7］，推測 α-syn也可能存在于腫瘤細胞中，并發(fā)揮與γ-syn類似的作用。本課題組利用免疫組織化學方法證明α-syn在人腦膜瘤組織中的表達，觀察其與β-微管蛋白之間的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 組織切片

人腦組織切片來自首都醫(yī)科大學天壇醫(yī)院神經(jīng)外科患者經(jīng)手術切除的腦組織，其中20例為腦膜瘤組織。5例為癲癇病人異常放電腦組織，作為對照腦組織。所有組織均制備成石蠟包埋切片。

1.1.2 主要試劑

兔抗人α-syn多克隆抗體、鼠抗人α-syn單克隆抗體 3D5 均由本室制備［8-9］;鼠抗人突觸素(synaptophysin，SYP)抗體(美國Santa cruz公司);鼠抗人β-微管蛋白單克隆抗體、生物素標記山羊抗兔IgG、生物素標記山羊抗小鼠IgG、鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶、FITC標記山羊抗兔IgG、TRITC標記山羊抗小鼠IgG(美國Vector Laboratory公司);其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色

將腦組織切片依次通過二甲苯、不同濃度乙醇和檸檬酸緩沖液進行脫蠟和抗原修復，3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液封閉，然后與不同抗人 α-syn的抗體(兔多克隆抗體 1∶10 000、3D5 1∶4 000)于4℃反應過夜，與生物素標記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG(1∶1 000)室溫反應2 h，再與鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶(1∶1 000)室溫反應1 h，用含有DAB的顯色液顯色，在顯微鏡下觀察結果。

1.2.2 免疫熒光雙重標記

脫蠟和抗原修復腦組織切片，經(jīng)3%BSA封閉后，在4℃條件下與兔抗人α-syn多抗(1∶500)和鼠抗人β-微管蛋白單抗(1∶50)或鼠抗人 SYP單抗(1∶400)反應過夜，再與FITC標記的山羊抗兔IgG(1∶800)和TRITC明標記的山羊抗小鼠IgG(1∶800)室溫反應2 h。熒光標記結果用熒光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結果

2.1 α-syn在對照腦組織中的表達

在正常腦組織中，α-syn免疫活性物質呈細小的顆粒狀，均勻分布于腦組織的神經(jīng)元之間，提示這種蛋白在神經(jīng)末梢存在(圖1)。免疫熒光雙重標記證明，α-syn在神經(jīng)末梢與突觸特異蛋白突觸素共存。α-syn免疫活性物質還見于神經(jīng)元的胞體和近端突起部位。α-syn在神經(jīng)元末梢與 β-微管蛋白共存(圖2)。

2.2 α-syn在腦膜瘤組織中的表達

在腦膜瘤組織，α-syn免疫陽性細胞呈漩渦狀或巢狀分布。α-syn免疫活性物質主要分布于腫瘤細胞的胞質與核膜。此外，α-syn也見于少數(shù)腫瘤細胞的胞核中。在不同腫瘤細胞團中的α-syn免疫活性物質的含量不同，有些細胞團含量較高，而另一些則較低(圖3，4)。兩種不同抗體所顯示 α-syn的表達位置相同。

免疫熒光雙重標記結果顯示，在腦膜瘤細胞中，α-syn和β-微管蛋白在胞質均呈陽性反應，并且共存(圖5)，在腫瘤組織中β-微管蛋白表達量多，而在正常組織中表達量則較少。

圖1 抗人α-syn抗體顯示α-syn在對照腦組織中的分布Fig.1 Anatomical distribution of α-syn in control humen brain

圖2 免疫熒光雙重標記顯示α-syn和突觸素、β-微管蛋白在對照腦組織中共存Fig.2 Double immunofluorescent labeling by polyclonal antibody of α-syn and SYP/β-tubulin antibody

圖3 抗人α-syn多克隆抗體顯示α-syn在腦膜瘤組織中的分布Fig.3 Anatomical distribution of α-syn in meningiomas tissue by polyclonal antibody

3 討論

本課題組采用了2種抗人α-syn抗體進行免疫組織化學染色，均證明α-syn在腦膜瘤組織中腫瘤細胞的胞質與胞核中存在。而在正常腦組織，α-syn免疫活性物質除少量存在于神經(jīng)元的胞體和近端突起部位外，主要呈細小的顆粒狀分布于神經(jīng)元之間，這些α-syn免疫活性物質與突觸特異性蛋白突觸素共存，提示α-syn在正常腦組織存在于神經(jīng)末梢的突觸前終末。以往研究［10-11］表明，α-syn 主要存在于具有神經(jīng)元分化特性的腦腫瘤中，而在非神經(jīng)元來源的腦膜瘤則不表達。本研究結果表明，非神經(jīng)元來源的腦腫瘤也表達 α-syn。

圖4 3D5顯示α-syn在腦膜瘤組織中的分布Fig.4 Anatomical distribution of α-syn in meningiomas tissue by 3D5

圖5 免疫熒光雙重標記顯示α-syn和β-微管蛋白在腦膜瘤組織中共存Fig.5 Double immunofluorescent labeling by polyclonal antibody of α-syn and β-tubulin antibody

α-syn在腦膜瘤細胞中的功能尚不清楚。以往研究［6-7］表明，α-syn 家族的另一個成員 γ-syn 與腫瘤細胞的增生、遷移、侵襲性有關，γ-syn對腫瘤細胞的影響與其促進微管蛋白組裝成微管有關。鑒于α-syn與γ-syn在氨基酸序列上具有高度的一致性，體外研究［4］證明，α-syn也具有促進微管的聚合的作用，推測α-syn在腦膜瘤細胞也可能參與微管的形成過程，并進而影響腫瘤的增生、遷移和侵襲性。作為支持這一推測的證據(jù)有α-syn在腦膜瘤細胞與β-微管蛋白共存，提示α-syn與微管組裝具有密切的關系。支持以上推測的另一個證據(jù)是，本課題組以往的研究［5］表明，α-syn可以促進細胞的增生，而其促進細胞增生的活性部位與其促進微管聚合的活性部位相同，均在其蛋白質羧基末端。

微管作為細胞的重要骨架蛋白參與的核分裂與胞質分裂過程［12］，而β-微管蛋白是構成微管的主要成分。鑒于微管參與細胞分裂過程中的核分裂和胞體分裂以及腫瘤細胞的遷移［13-15］，推測 α-syn 也可能與腫瘤的增生、遷移和侵襲性有關。

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