左曉虹 劉 姝 林慶玲 李 寧 陳 彪 蔡彥寧

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，教育部神經(jīng)變性病重點實驗室北京 100053)

mPer1(mPeriod 1)、mPer2(mPeriod 2)、mCry1(cryptochrome 1)和mDBP(D site of albumin promoter binding protein)等節(jié)律基因的節(jié)律性表達是通過其基因啟動子區(qū)域的 E-box和 BMAL1〔brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator(ARNT)-like〕/CLOCK異源二聚體的結(jié)合來調(diào)節(jié)，其結(jié)合在節(jié)律基因日波動表達的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用［1-4］。但是這些基因的E-box與BMAL1/CLOCK的結(jié)合方式有明顯不同。在經(jīng)典節(jié)律器官——肝臟中，mPer1、mPer2的 E-box 全天持續(xù)穩(wěn)定和 BMAL1/CLOCK 結(jié)合［3，5］，而mCry1和mDBP的E-box和BMAL1/CLOCK的結(jié)合在一天之中呈動態(tài)變化［2，4］，mCry1 E-box 的結(jié)合高峰出現(xiàn)在開燈后(hours after light onset，HALO)3～9 h，低點在 HALO 15 ～18 h［6］;mDBPE-box 的結(jié)合高峰出現(xiàn)在HALO 5～11 h，低點在HALO 17～23 h。影響基因和蛋白相互作用的因素很多，包括蛋白含量、NAD(P)/NAD(P)H濃度、蛋白磷酸化水平等，但在同一個細胞內(nèi)，這些因素是相同的，因此我們推測影響E-box和異源二聚體結(jié)合差異的原因極可能是由于E-box及其周圍的序列差異造成的。

人們普遍認為MAP激酶磷酸化酶1(MAP kinase phosphatise 1，MKP1)是一種典型的時鐘控制基因(clock-controlled gene，CCG)，其啟動子區(qū)有一個功能節(jié)律性的E-box［7］。MKP1的轉(zhuǎn)錄水平在小鼠視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)呈現(xiàn)強節(jié)律性表達，而在肝臟呈現(xiàn)弱節(jié)律表達，在腎臟有持續(xù)穩(wěn)定的表達［8］，因此可以推測組織特異性的E-box及其周圍的序列可能決定了MKP1的組織特異性表達。

由于在經(jīng)典形式(如mPer1、mCry1、mDBP和mMKP1中)和非經(jīng)典形式(如mPer2中)的E-box中常常包含DNA甲基化潛在靶點——CpG雙核苷酸，因此有研究推測E-box的甲基化極可能參與分子水平的節(jié)律性表達［9］。此外大多數(shù)E-box都位于CpG島中，附近其他CpG島序列的甲基化亦可能調(diào)節(jié)E-box的節(jié)律性功能活動。在腫瘤組織和細胞系中發(fā)現(xiàn)一些E-box和CpG島在發(fā)育過程中被甲基化［10-13］。本實驗組前期實驗［14］結(jié)果也表明mPer1的E-box3和E-box4發(fā)生明顯甲基化。

為更好地了解甲基化在E-box和BMAL1/CLOCK異源二聚體相互作用中是否起調(diào)節(jié)作用以及甲基化是否在MKP1的組織特異性表達中起決定作用，本研究將采用重硫酸鹽基因組測序法檢測mPer2、mCry1、mDBP和mMKP1啟動子區(qū)含E-box的CpG島的甲基化形式。結(jié)果表明甲基化與所有E-box與BMAL1/CLOCK異源二聚體的節(jié)律性結(jié)合無關(guān)，大部分含E-box的CpG島也與甲基化無關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性C57 BL/6J小鼠18只，8周齡，體質(zhì)量18～20 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號:SCXK-(軍)-2007-004。

1.2 主要試劑、藥物和器械

QIAamp DNA mini試劑盒(美國Qiagen公司)，Wizard DNA純化試劑盒(美國 Promega公司)，HS Taq(日本Takara公司)。

1.3 動物分組與實驗處理

小鼠按如下條件飼養(yǎng)2周:飲食、飲水自由，早8:00開燈、晚20:00關(guān)燈，12 h照明、黑暗循環(huán)。2周后采用數(shù)字表法隨機分6組，每組3只，從早9:00開始每隔4 h取1組動物的肝臟、腎臟。

1.4 E-box和CpG島的選擇

檢測以下基因E-box和旁側(cè)區(qū)域CpG島的甲基化位點:肝臟mPer2、mCry1、mDBP、mMKP1 以及腎臟mMKP1。具體選擇5個特定的E-box:mPer2非典型E-box［3］、mCry1 在-270 和-265 之間的 E-box［2］、mDBP2個內(nèi)含子區(qū)域以及mMKP1啟動子區(qū)E-box［7］。

1.5 制備基因組DNA和重硫酸鹽處理

基因組DNA用QIAamp DNA mini試劑盒制備。在重硫酸鹽處理過程中所有胞嘧啶將轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，?'甲基化胞嘧啶保持不變。先將基因組DNA用0.3 mmol/L NaOH變性處理，再加入偏亞硫酸氫鈉(pH 5.0)和對苯二酚使終濃度分別為3.0 mmol/L和0.5 mmol/L。反應(yīng)混合物上加礦物油，避光，于50℃孵育16 h。修飾后的DNA用Wizard DNA純化試劑盒純化后用0.3 mmol/L NaOH處理15 min，乙醇沉淀。

1.6 擴增、測序

經(jīng)重硫酸鹽處理的DNA樣品用HS Taq擴增，選用4個基因CpG島的引物見表1。將相同基因同一時間點相同組織的3個DNA擴增產(chǎn)物混合，克隆到pGEMT載體，挑選10～15個克隆送北京諾賽基因生物公司測序。相同實驗重復(fù)3次。

1.7 結(jié)果分析

用網(wǎng)上軟件(MethPrimer)分析每個基因E-box和周圍CpG島的數(shù)目;通過對比所有測序數(shù)據(jù)，評估每個基因甲基化的狀態(tài)。

表1 用于重硫酸鹽處理后PCR的引物Tab.1 Oligonucleotide primer sequences used in bisulfite PCRs

2 結(jié)果

2.1 MethPrimer分析結(jié)果

每個基因的E-box及旁側(cè)序列見圖1A，用網(wǎng)上軟件(MethPrimer)分析E-box中的CpG島，選擇限制:100 bp，CpG島比率≥0.6。分析結(jié)果顯示以上5個 E-box均包含一個假定的CpG島，見圖1。

圖1 基因啟動子區(qū)擴增序列匯總Fig.1 Summary of promoter regions subject to bisulfite genomic sequencing

2.2 肝臟中 mCry1、mDBP、mPer2 E-box和周圍CpG島的甲基化狀態(tài)

重硫酸鹽處理基因組DNA測序用于檢測E-box和周圍CpG島的甲基化狀態(tài)。如表2所示，mCry1共檢測59個CpG島，E-box在第3個CpG島位點;mDBP有22個CpG島，包含2個E-box分別在第6個和19個CpG島位點;mPer2有54個CpG島，E-box在第10個CpG島位點。

表2 節(jié)律基因重硫酸鹽處理后PCR產(chǎn)物大小以及CpG島數(shù)目Tab.2 PCR products and number of CpG in every gene

圖2、3、4分別顯示肝臟中6個時間點mCry1、mDBP、mPer2 E-box的甲基化狀態(tài)，表明mCry1、mDBP、mPer2 E-box甲基化不明顯，而且包含E-box的CpG島也更大程度表現(xiàn)為非甲基化狀態(tài)。

圖2 肝臟6個時間點mCry1 E-box和周圍CpG島的甲基化狀態(tài)Fig.2 Examination of methylation status of E-box containing CpG islands in the promoter of mCry1

2.3 肝臟和腎臟中mMKP1 E-box和周圍CpG島的甲基化狀態(tài)

Cyber分析表明mMKP1的E-box為第22個CpG島，共有40個CpG島，如圖5所示，測序結(jié)果表明在肝臟和腎臟中E-box和周圍CpG島的甲基化無明顯差異。

圖3 肝臟6個時間點mDBP E-box和周圍CpG島的甲基化狀態(tài)Fig.3 Examination of methylation status of E-box containing CpG islands in the promoter of mDBP

圖4 肝臟6個時間點mPer2 E-box和周圍CpG島的甲基化狀態(tài)Fig.4 Examination of methylation status of E-box containing CpG islands in the promoter of mPer2

3 討論

圖5 肝臟和腎臟01HALO mMKP1 E-box和周圍CpG島的甲基化狀態(tài)Fig.5 Examination of methylation status of E-box containing CpG islands in the promoter of mMKP1

已有學(xué)者［2-5］利用定量染色質(zhì)免疫沉淀-PCR的方法研究肝臟中BMAL1/CLOCK異源二聚體與mPer1、mPer2、mCry1和mDBP等節(jié)律基因的E-box之間的相互作用，這些結(jié)果表明BMAL1/CLOCK異源二聚體與不同節(jié)律基因的E-box之間的結(jié)合方式不同，它們與mPer1、mPer2的E-box 24 h內(nèi)持續(xù)結(jié)合，而與mCry1、mDBP的結(jié)合呈現(xiàn)日節(jié)律變化，與mCry1的結(jié)合高峰在HALO 03～09 h，低點在HALO 15～18 h;與DBP的結(jié)合高峰在 HALO 05～11 h，低點在 HALO 17～23 h。我們推測mCry1、mDBP的E-box甲基化水平在24 h呈波動性波動，并且影響蛋白和DNA的相互作用;而mPer1、mPer2啟動子E-box的甲基化水平保持恒定。由于mPer1 E-box的甲基化狀況已有研究組［14］檢查過，此次研究主要檢測mPer2、mCry1 和mDBP啟動子E-box的甲基化水平。本研究的結(jié)果中所有E-box無明顯甲基化狀態(tài)，而且包含E-box的CpG島也更大程度表現(xiàn)為非甲基化狀態(tài)。這些結(jié)果證明在肝臟中DNA甲基化不會影響B(tài)MAL1/CLOCK異源二聚體與節(jié)律基因mPer2、mCry1和mDBP啟動子E-box之間的相互作用。不同啟動子與BMAL1/CLOCK異源二聚體結(jié)合方式的細微差別的潛在機制將有待于從其他角度進一步研究。

MKP1在SCN和肝臟中的表達是節(jié)律性的，但在腎臟中不具有節(jié)律性［7］。表明由分子時鐘機制控制的MKP1的表達有組織特異性。我們推測腎臟中MKP1啟動子的功能性E-box可能被甲基化并保持持續(xù)不與BMAL1/CLOCK異源二聚體結(jié)合。為檢驗這一假說的正確性，我們檢測肝臟和腎臟中MKP1在HALO 01 h的甲基化狀態(tài)。Cyber分析結(jié)果證實mMKP1的E-box為第22個CpG島，共有40個CpG島，測序結(jié)果表明在肝臟和腎臟中E-box和周圍CpG島甲基化狀態(tài)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這些結(jié)果證實DNA的甲基化不參與MKP1的組織特異性分子時鐘調(diào)控。

到目前為止，通過微矩陣分析已有數(shù)千個時鐘控制基因(clock control gene，CCG)被證實［15］，而這些CCG中只有一小部分在不同組織中有相同的表達模式，多數(shù)CCG因受到組織特異的分子時鐘機制的調(diào)控在不同組織中有特異性的表達模式，它們多通過E-box和BMAL1/CLOCK異源二聚體的節(jié)律性結(jié)合來調(diào)節(jié)基因的表達［16］。本研究組研究結(jié)果證實DNA甲基化在CCG的組織特異性調(diào)控中并不起決定性作用。

總之，本研究結(jié)果和我們的前期研究［14］結(jié)果證實節(jié)律基因的E-box默認處于非甲基化狀態(tài)，便于其能與BMAL1/CLOCK異源二聚體相結(jié)合。而節(jié)律基因組織特異性表達的具體機制有待于進一步研究。

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