童彥杰，王啟軍，馬亞麗，呂椰子，劉洋洋，張 瑞，吳元欣，朱圣東*

(1. 武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，綠色化工過程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省新型反應(yīng)器和綠色工藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074；2.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

0 引 言

盡管離子液體不會(huì)揮發(fā)進(jìn)入環(huán)境而造成大氣污染，但在離子液體大規(guī)模工業(yè)化使用過程中，仍有可能在事故狀態(tài)或是通過泄露而進(jìn)入環(huán)境造成水體或是土壤污染[7].因此，離子液體的的毒性數(shù)據(jù)，作為離子液體工業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的一個(gè)重要組成部分，有必要進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究[8].對(duì)離子液體的毒性人們已經(jīng)進(jìn)行了一些初步的研究工作，包括在分子和細(xì)胞層面的毒性研究及對(duì)微生物、植物和動(dòng)物在個(gè)體和種群層面的毒性研究，并已經(jīng)總結(jié)出了一些離子液體結(jié)構(gòu)與毒性之間的關(guān)系規(guī)律[9-12].然而根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)來看，在離子液體的毒性研究方面，毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)象僅限于分子和細(xì)胞層面以及個(gè)體和種群層面，未見毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)象在生物群落和生態(tài)層面上的毒性研究報(bào)道.而離子液體毒性研究的目的在于了解離子液體對(duì)生物群落以及生態(tài)環(huán)境的影響.因此本實(shí)驗(yàn)以研究最為深入的離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯化鹽(1-butyl-3-methylimidazolium chloride，[BMIM]Cl)為研究對(duì)象，對(duì)荒地和苗圃兩種土壤的理化性質(zhì)以及土壤微生物群落影響進(jìn)行研究.由于放線菌與人類生活生產(chǎn)有著密切關(guān)系，以及其在污水處理方面的應(yīng)用，并且在土壤中有著主要的分布，因此本實(shí)驗(yàn)選取放線菌和細(xì)菌作為微生物群落的研究對(duì)象.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)土樣 荒地土壤樣品取自于武漢市郊區(qū)的廢棄農(nóng)業(yè)用地，苗圃土壤樣品取自于武漢工程大學(xué)園林花卉中心.每個(gè)采樣區(qū)隨機(jī)選取10個(gè)以上的取土點(diǎn)，去掉地表層土壤，采集1～15 cm深度范圍的土壤，然后將不同點(diǎn)的土壤充分混合.室溫風(fēng)干，過篩，顆粒小于2 mm，裝入塑料袋，4 ℃儲(chǔ)藏，備用.

荒地土壤樣品和苗圃土壤樣品都分成8分，1份作為對(duì)照組，不加入[BMIM]Cl，其余7份分別加入不同質(zhì)量濃度的[BMIM]Cl，使實(shí)驗(yàn)樣品中[BMIM]Cl的質(zhì)量濃度分別為10 g·kg-1、1 g·kg-1、0.1 g·kg-1、0.01 g·kg-1、0.001 g·kg-1、0.000 1 g·kg-1和0.000 01 g·kg-1.在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫放置兩周后，再用于理化性質(zhì)和微生物數(shù)量的測(cè)定測(cè)定.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)用離子液體[BMIM]Cl購(gòu)自河南利華制藥公司.其它實(shí)驗(yàn)化學(xué)藥品均購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生物培養(yǎng)基購(gòu)自于北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 理化性質(zhì)的測(cè)定a．pH值的測(cè)定.稱取過篩的土壤樣品10.0 g，置于裝有25.0 mL去離子水的玻璃瓶中，攪拌均勻，靜止30 min，以BeckmanΦ690酸度計(jì)測(cè)量[13].

b．土壤可溶性鹽含量的測(cè)定.稱取經(jīng)過篩(篩孔1 mm2)的風(fēng)干土粉40 g，加入經(jīng)煮沸冷卻后的蒸餾水200 mL，振蕩3 min后過濾，取濾液50 mL，放在經(jīng)烘干稱出一定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后滴加2～3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～15%的雙氧水以氧化除去有機(jī)雜質(zhì)，再蒸干，再加雙氧水，再蒸干，反復(fù)數(shù)次至殘?jiān)拾咨蚵詭S色為止，在105 ℃～110 ℃的恒溫烘箱中烘至恒重，稱出蒸發(fā)皿加殘?jiān)目傎|(zhì)量[13].

c．土壤有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定. 土壤有機(jī)質(zhì)含量采用沖鉻酸鉀滴定法，具體方法參照GB 9834-88.

1.2.2 生物量的測(cè)定a．土壤中微生物活菌計(jì)數(shù). 采用微生物活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定土樣中的微生物[14].稱取土樣10.0 g，裝入90 mL無菌水中，振蕩30 min，取1.0 mL土壤懸液于裝有9.0 mL無菌水的試管中，充分混勻，再取1.0 mL土壤懸液于裝有9.0 mL無菌水的試管中，充分混勻，依次稀釋6次.然后吸取不同稀釋度的菌懸液各0.1 mL至培養(yǎng)基已凝固的培養(yǎng)皿中，用刮產(chǎn)涂布均勻.細(xì)菌計(jì)數(shù)用牛肉膏蛋白胨-制霉菌素培養(yǎng)基；放線菌計(jì)數(shù)用高氏一號(hào)培養(yǎng)基.28 ℃倒置培養(yǎng)細(xì)菌2 d、放線菌3 d后統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)皿的菌落數(shù)(colony forming units，CFU).計(jì)算土壤中微生物的數(shù)量.每個(gè)土樣做3次重復(fù).

b．半有效濃度EC50測(cè)定. 半有效濃度是毒理研究中的一個(gè)重要指標(biāo)，表示毒物對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用強(qiáng)弱程度，定義為微生物數(shù)量為對(duì)照組50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的毒物濃度.本實(shí)驗(yàn)采用平板計(jì)數(shù)法來確定離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤微生物(包括細(xì)菌和放線菌)的半有效濃度[15].

2 結(jié)果與討論

2.1 不同含量的離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

2.1.1 不同含量的離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤可溶性鹽含量的影響 離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤的可溶性鹽含量的影響如圖1所示.隨著離子液體[BMIM]Cl的含量的增大，可溶性鹽含量明顯呈上升趨勢(shì).由于離子液體[BMIM]Cl本身在水中有較高的溶解度，所以作為一種可溶性鹽，在土壤中，離子液體[BMIM]Cl仍舊以離子態(tài)存在，而且因?yàn)槠浯嬖冢€可能影響土壤的滲透壓從而對(duì)土壤的生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生影響.另外，從圖1可知，荒地土壤樣品的可溶性鹽含量比苗圃土壤樣品略高，對(duì)照組中，荒地土壤樣品的可溶性鹽含量為(0.77±0.037) g·kg-1，而苗圃土壤樣品的可溶性鹽含量為(0.68±0.033) g·kg-1.但總的來說，雖然荒地和苗圃兩個(gè)土樣的樣地點(diǎn)和肥沃程度都不同，但是其可溶性鹽含量相當(dāng)接近，這說明土壤中的可溶性鹽含量相對(duì)固定，相對(duì)于離子液體[BMIM]Cl來說，受土壤微生物，植物和人類活動(dòng)影響較小.

圖1 不同含量離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤可溶性鹽含量的影響

2.1.2 不同含量離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤pH值的影響 離子液體[BMIM]Cl對(duì)荒地和苗圃土壤樣品pH的影響見圖2.從圖2可知，雖然荒地土壤的對(duì)照組pH值(6.76±0.03)比苗圃土壤對(duì)照組(6.47±0.03)要高，但是隨著離子液體[BMIM]Cl含量的增加，土壤pH值的變化逐漸明顯.而且，不難發(fā)現(xiàn)，在較低質(zhì)量濃度的離子液體[BMIM]Cl存在的情況下，苗圃土壤樣品對(duì)離子液體[BMIM]Cl的敏感度要比荒地樣品高.這種現(xiàn)象的原因是因?yàn)橥寥辣旧韺?duì)酸堿有一定的調(diào)節(jié)作用，一旦離子液體[BMIM]Cl的含量過大，超出土壤自身的調(diào)節(jié)范圍，就會(huì)導(dǎo)致土壤pH值的急劇降低.由此可見離子液體[BMIM]Cl作為一種強(qiáng)酸弱堿鹽，在一定質(zhì)量濃度下能夠?qū)е峦寥纏H值相應(yīng)的變化.

圖2 不同含量的離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤pH值的影響

2.1.3 不同含量離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)含量的影響 離子液體[BMIM]Cl對(duì)荒地土壤和苗圃土壤的影響如圖3所示，隨著離子液體[BMIM]Cl含量的增加，土壤中有機(jī)質(zhì)含量也呈上升趨勢(shì)；并且變化趨勢(shì)與可溶性鹽含量和pH值的變化趨勢(shì)相似，土壤中有機(jī)質(zhì)含量在低濃度的離子液體[BMIM]Cl土壤樣品中變化較小，在高濃度的離子液體[BMIM]Cl土壤樣品中變化較大.由于兩種土壤樣品的肥沃程度不同，有機(jī)質(zhì)含量也有很大的不同.在荒地土壤樣品中，對(duì)照組的有機(jī)質(zhì)含量為(8.38±0.35) g·kg-1；苗圃土壤樣品中對(duì)照組的有機(jī)質(zhì)為(12.41±0.49) g·kg-1，是荒地的1.48倍.因此，離子液體[BMIM]Cl作為一種陽離子為有機(jī)物質(zhì)的可溶性鹽，在其加入到土壤后，土壤的有機(jī)質(zhì)總含量受到一定影響.

2.2 不同含量的離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤微生物群落的影響

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中一個(gè)重要的成分，對(duì)土壤中生命物質(zhì)的新陳代謝起著關(guān)鍵的作用.因此對(duì)土壤微生物的分析，是對(duì)離子液體生態(tài)毒性分析的一個(gè)重要的指標(biāo).

圖3 不同含量的離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)含量的影響

表1給出了兩種不同土壤樣品中細(xì)菌和放線菌在不同濃度離子液體[BMIM]Cl作用下微生物數(shù)量的變化數(shù)據(jù).從表1中可知，由于兩種土壤樣品的取樣地點(diǎn)和其相應(yīng)的人類活動(dòng)不同，其細(xì)菌和放線菌數(shù)量有著非常顯著的差異.放線菌的數(shù)量在在荒地土壤樣品的對(duì)照組(11.6±0.83×106)和苗圃土壤樣品的對(duì)照組(8.60±0.81×105)中整整相差一個(gè)數(shù)量級(jí)；而細(xì)菌在苗圃土壤樣品中對(duì)照組的數(shù)量是在荒地中對(duì)照組數(shù)量的2倍.因此，由于所選樣品的顯著差異，其微生物含量也有著明顯的差異.

無論是在荒地土壤樣品還是在苗圃土壤樣品中，隨著離子液體[BMIM]Cl含量的增加，無論是放線菌還是細(xì)菌的數(shù)量都在相應(yīng)的減少.從而明顯的體現(xiàn)出離子液體[BMIM]Cl加入后，對(duì)微生物群落生長(zhǎng)和代謝的抑制作用.

圖4給出了離子液體[BMIM]Cl對(duì)荒地土壤和苗圃土壤的細(xì)菌和放線菌的半有效濃度.從圖4可以看出，無論在荒地土壤樣品中細(xì)菌還是放線菌的的半有效濃度都小于苗圃土壤樣品.而就同種土壤中的細(xì)菌和放線菌的半有效濃度而言，荒地土壤樣品中細(xì)菌的半有效質(zhì)量濃度為0.032 5 g·kg-1，小于放線菌的半有效質(zhì)量濃度0.043 8 g·kg-1；而苗圃土壤樣品中細(xì)菌的半有效質(zhì)量濃度為0.486 g·kg-1，大于放線菌的半有效質(zhì)量濃度0.447 g·kg-1.由此可知微生物的半有效質(zhì)量濃度跟其在土壤中的含量有著密切的關(guān)系，生物的群落越大，其半有效濃度也相應(yīng)的越大.

表1 不同含量離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響

圖4 離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤微生物群落的半有效濃度

3 結(jié) 語

通過離子液體[BMIM]Cl對(duì)兩種不同土壤的理化性質(zhì)和微生物群落影響的實(shí)驗(yàn)和分析，得出如下結(jié)論：

a.離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤理化性質(zhì)影響的研究表明，土壤中的有機(jī)質(zhì)含量和可溶性鹽含量隨著離子液體[BMIM]Cl濃度的增加而增加，但是pH值隨著離子液體[BMIM]Cl濃度的增加而降低.

b. 離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤微生物群落影響的研究表明，隨著離子液體[BMIM]Cl濃度的逐漸增大對(duì)土壤的微生物群落有著明顯的抑制作用.通過對(duì)荒地和苗圃兩種土壤樣品中細(xì)菌微生物群落和放線菌微生物群落的離子液體[BMIM]Cl半有效濃度的的測(cè)定，對(duì)離子液體[BMIM]Cl的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行補(bǔ)充和量化，而且也證明了離子液體[BMIM]Cl對(duì)土壤生物群落的毒性.

4 致 謝

本工作得到湖北省新型反應(yīng)器與綠色工藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(RGCT201005)的資助，實(shí)驗(yàn)過程中得到華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭世學(xué)博士的指導(dǎo)與幫助，對(duì)此表示感謝！

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