李發(fā)玲, 李景富, 康立功, 張 賀, 許向陽

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系,哈爾濱 150030)

番茄枯萎病是番茄生產(chǎn)特別是保護(hù)地栽培的重要病害之一,是番茄生產(chǎn)中一個(gè)重要的限制性因素。由于枯萎病是土傳性病害,其病菌抗逆性強(qiáng),藥劑防治效果不理想。因此,選育和利用抗病品種是番茄枯萎病的主要防治方法。

早在1940年,人們就發(fā)現(xiàn)番茄枯萎病病菌有生理小種分化,并存在2個(gè)生理小種[1-3]?？菸∈怯娠@性單基因控制[4]。通過F.o.lycopersici和栽培番茄的相互作用,目前已發(fā)現(xiàn)有3個(gè)不同的抗病基因[3-7],分別為 I-1、I-2、I-3?？股硇》N1的基因?yàn)镮-1;抗生理小種2的基因?yàn)镮-2;對(duì)生理小種1和生理小種2都具有抗性的基因?yàn)?I-3。目前,對(duì)I-2、I-3基因的研究較深入,I-2已進(jìn)行到克隆階段[8],I-3基因已被 RFLP[9]、AFLP[10]、SCAR[11]、CAPS[12]等技術(shù)精確作圖。但對(duì)I-1基因的研究不夠深入,Bohn[13],Paddock[14]把 I-1基因定位到第11條染色體上,而Sarfatti[15]把I-1基因定位到第7條染色體上。

在分子標(biāo)記技術(shù)中,AFLP技術(shù)和SSR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因的分子標(biāo)記、定位、遺傳圖譜構(gòu)建等方面。與其他技術(shù)相比,AFLP技術(shù)多態(tài)性豐富、DNA用量少檢測效率高、不受環(huán)境影響、無復(fù)等位效應(yīng)、帶紋豐富、無需預(yù)知基因組的序列信息;SSR技術(shù)多態(tài)性高、重復(fù)性好、具有共顯性、操作簡單。本研究利用AFLP技術(shù)和SSR技術(shù),篩選與番茄枯萎病抗病基因I-1連鎖的AFLP標(biāo)記和SSR標(biāo)記,為加快番茄抗枯萎病育種、豐富番茄遺傳圖譜和番茄分子標(biāo)記輔助育種提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 番茄材料

本試驗(yàn)以抗枯萎病品種‘05045'(含I-1基因)為母本,感病品種‘051451'為父本,配制雜交組合獲得F1代,通過在海南島加代獲得F2代。上述材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系番茄課題組提供。

1.1.2 番茄枯萎病菌

番茄枯萎病菌屬生理小種1,由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系番茄課題組提供。

1.1.3 試劑

試驗(yàn)所用的AFLP接頭、AFLP引物、SSR引物均由上海生工生物工程公司合成,RNase、Taq聚合酶、MseI、EcoRI、T4連接酶均為美國 MBI公司產(chǎn)品,dNTP為 TaKaRa公司產(chǎn)品,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 番茄枯萎病抗性鑒定

把在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)了7 d的番茄枯萎病病菌制備成分生孢子含量為107個(gè)/mL的菌懸液,采用浸根法結(jié)合注射法,在F2代群體1～2片真葉時(shí)接種,遮光處理1周,25 d后調(diào)查并記錄發(fā)病情況。將F2代群體分為抗病和感病兩類。

1.2.2 葉片總DNA的提取

在發(fā)病高峰期分別取抗病和感病各20株幼嫩葉片,采用改良的CTAB法[16]提取葉片DNA,用于構(gòu)建抗感池。再取各F2單株幼嫩葉片,提取DNA,用于選擇性擴(kuò)增。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測DNA質(zhì)量和濃度。

1.2.3 AFLP標(biāo)記

AFLP標(biāo)記參照 Vos的方法[17]。酶切采用EcoRⅠ/MseⅠ雙酶切;預(yù)擴(kuò)增引物采用 E00和M00;選擇性擴(kuò)增采用E引物和M引物組合的870對(duì)引物。PCR產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,80W恒功率電泳2h,銀染后觀察。

1.2.4 SSR標(biāo)記

SSR標(biāo)記參照優(yōu)化的SSR體系[18]。采用319對(duì)引物。PCR產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,75W恒功率電泳1h,銀染后觀察。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及連鎖距離分析

利用χ2檢驗(yàn)分析AFLP、SSR多態(tài)性標(biāo)記與抗病和感病植株的性狀分離情況。應(yīng)用Map Maker 3.0軟件計(jì)算連鎖遺傳距離,臨界LOD值取3.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病性鑒定結(jié)果

對(duì)F2代群體的348個(gè)單株進(jìn)行了番茄枯萎病抗病性鑒定,其中抗病259株,感病89株。χ2=0.113,符合顯性單基因的遺傳規(guī)律。

2.2 AFLP標(biāo)記

2.2.1 引物篩選

用父母本‘051451'和‘05045'對(duì)870對(duì)選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行篩選。篩出差異引物392對(duì),篩出差異性較好的引物51對(duì)。在抗感池中對(duì)篩選出的51對(duì)多態(tài)性較好的引物進(jìn)行復(fù)選,篩出24對(duì)差異性多和多態(tài)性好的引物。(見表1)

表1 篩出的24對(duì)差異性好的AFLP特異引物

2.2.2 F2單株P(guān)CR擴(kuò)增

利用篩選出的24條引物對(duì)348株F2代群體進(jìn)行擴(kuò)增。利用MapMaker3.0軟件進(jìn)行連鎖分析,結(jié)果表明：E41M60-D(280 bp)、E41M62-C(310 bp)、E86M36-B(420 bp)和E32M44-E(120 bp),與抗病基因I-1的連鎖遺傳距離分別為4.7、5.3、8.9、11.5cM。其中E41M60-D見圖1,其余圖片略。

2.2 SSR標(biāo)記

2.2.1 引物篩選

用父母本‘051451'和‘05045'對(duì) 319對(duì) SSR引物進(jìn)行篩選。篩出父母間差異好的引物25對(duì)。然后在基因池中進(jìn)行復(fù)選,篩出16對(duì)差異顯著且穩(wěn)定的引物(見表2)。

圖1 引物E41M60在部分F2單株中的擴(kuò)增結(jié)果

表2 篩出的16對(duì)差異性好的SSR特異引物

2.2.2 F2單株P(guān)CR擴(kuò)增

用篩選出的16條引物對(duì)348株F2代群體進(jìn)行擴(kuò)增。利用MapMaker 3.0軟件進(jìn)行連鎖分析,結(jié)果表明：SSR108(如圖 2)、SSR276(圖略)與抗病基因I-1的連鎖遺傳距離分別為6.1、9.3cM。

圖2 引物SSR108在部分F2單株中的擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

番茄枯萎病是土傳性病害,病菌長年累積發(fā)病才充分,而在試驗(yàn)條件下充分發(fā)病是一大難題。本研究采用浸根法結(jié)合注射法,在浸根20 min后,再注入0.5 mL的菌懸液,以保證充分發(fā)病。將兩種常規(guī)的方法結(jié)合起來,使鑒定效率更高。

本研究所得到的 AFLP標(biāo)記 E41M60-D與抗病基因I-1的連鎖遺傳距離為4.7cM,為該基因定位和克隆、在番茄苗期開展抗性鑒定及番茄枯萎病的遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。番茄枯萎病病菌生理小種1在我國是優(yōu)勢小種,因此本研究所得到的標(biāo)記對(duì)開展番茄枯萎病抗病育種具有重要實(shí)踐意義。但由于親本之間親緣關(guān)系較近、某些DNA的降解導(dǎo)致聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染后條帶不清晰、不同批號(hào)的無水碳酸鈉對(duì)染色深淺的影響從而影響數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)等誤差,影響了遺傳距離的準(zhǔn)確性。因此,下一步可以利用新一代的操作更簡單、更準(zhǔn)確的分子標(biāo)記技術(shù)尋找更加緊密連鎖的標(biāo)記。

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