晉志高，何原芳，景向紅

(1.煤炭總醫(yī)院，北京 100028;2.中國中醫(yī)科學院針灸研究所，北京 100700)

糖尿病(diabetesmellitus，DM)是常見的內分泌代謝性疾病，可引起血管功能和結構的損傷，導致血流的改變而加重腦缺血，由此導致學習記憶障礙。本研究擬采用CREB為切入點，觀察針刺對糖尿病大鼠海馬和杏仁復合體內CREB表達的影響，為糖尿病腦病的研究和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物

Wister大鼠(雄性1個月齡)36只，體重180g±15g。

1.2 建立動物模型

1.2.1 學習和記憶能力訓練 隱藏平臺獲得實驗:實驗前動物自由游泳2min。正式實驗每天訓練4次，即由起點處將動物放入書中，游至終點經平臺出水為止。每次180s，隨機從東、西、南、北4個入水點選擇1個，將動物面向池壁放入水中，記錄動物尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期(escape latency)。

空間搜索實驗:用于測量動物對平臺空間位置準確記憶，即記憶保持能力。測量180s內:(1)動物在目標象限(原平臺所在象限)(target quadrant)和其他各象限的游泳時間;(2)動物在目標象限和其他各象限游泳路徑的長短。每次記錄潛伏期，即由入水到開始游泳的時間;運動時間，即由起點游到終點的時間;錯誤的次數，既改變游泳的方向或進入盲端的次數。每只動物共計訓練28次，實驗歷時7 d。計算每天各組動物4次逃避潛伏期的平均值。平均運行時間;正確率 (正確數/訓練次數)。最后以平均潛伏期小于5 s，平均運行時間小于15 s，正確率大于90%作為標準，判定是否建立了空間辨別性學習記憶模型。

1.2.2 DM學習記憶障礙模型的建立 試劑:鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，臨用前以無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制 pH=4.2，濃度為25mg/ml的工作液。美國 Ames公司 Glucometer3微量血糖測定儀和血糖試紙檢測。確定學習和記憶能力訓練成功后，36只大鼠隨機分為正常對照組(NC，9只)和模型組(27只)，模型組大鼠禁食10h，按50mg/kg劑量向大鼠腹腔內注入25mg/ml濃度的 STZ，注藥后48h測血糖，血糖連續(xù)2次超過168mmol/L并穩(wěn)定5d者選為糖尿病模型。

表1、2顯示，造模后第18天做行為學檢測，結果顯示DM模型組在目標象限停留時間百分比短，游距離的百分比也短，與正常組的游泳時間百分比及游泳距離百分比比較有顯著差異，說明糖尿病組動物存在明顯的空間學習記憶障礙。

24只動物經行為學測定被確認為學習記憶障礙，再將動物隨機分為模型組(DM)、針刺組(AP)、BDNF治療組(BD)3組，每組8只。

表1 治療前正常組與模型組游泳時間比較

表2 治療前正常組與模型組游泳距離比較

1.3 針灸及BDNF治療

1.3.1 針刺治療 被確認為學習記憶障礙后當天開始治療，針刺治療從調督脈入手，因督脈為陽脈之海，總督一身之陽。刺激督脈，可振奮一身之陽，促進生長發(fā)育;督脈絡腎入腦，刺督脈可補髓益腦，改善智力。選取督脈的“百會”、“大椎”，電針治療(2Hz，3mA)，留針 20min，隔日 1 次，共治療 10次。

1.3.2 BDNF治療 動物椎管內腔注射BDNF(10ug/kg體重，生理鹽水溶液)，第1周2次，共2次。

正常組和模型組動物與前2組動物在相同條件下飼養(yǎng)，不進行任何治療。

1.4 免疫組織化學實驗

動物治療3周后，再做行為學檢測，檢測后，3組動物均經1%戊巴比妥鈉(40mg/Kg體重)腹腔麻醉后，行常規(guī)心臟灌流固定。

1.4.1 取材 剪開前胸壁，縱形剪開心包，充分暴露心臟。0.2 ul肝素鈉抗凝，在心端左處的左心室插管至升主動脈，止血鉗將心臟與針頭固定，剪開右心耳，快速滴入室溫下的生理鹽水約定100ml沖洗。續(xù)用4℃的4%多聚甲醛(0.1BMP配制，pH=7.4)150ml～200ml灌注固定，先快后慢，40min灌完后立即開顱取腦。4℃冰箱過夜至組織塊沉底。

1.4.2 切片 對端腦做額狀面冰凍切片，組織于恒冷箱機切片機內行連續(xù)冠狀切片，片厚30μm，每隔2片取2片，裱片于預涂硌釩明膠的載玻片上，晾干后分為2套，用于免疫組織化學檢測。

1.4.3 免疫組化染色法(一抗為 BDNF，CREB)(1)切片經蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min;(2)滴加試劑 A(藍色液體)，室溫孵育 10min～15min，傾去勿洗;(3)滴加適當比例稀釋的一抗，室溫孵育24h;(4)PBS沖洗3min/次，3次;(5)滴加試劑B(黃色液體)室溫或37℃孵育10min～15min，過夜12h;(6)PBS沖洗，3min/次，3次;(7)DAB顯色，避光、顯色10min～30min，肉眼觀察;(8)自來水充分水洗;(9)脫水、透明、樹膠封片。

普通光學顯微鏡下觀察各組動物海馬、杏仁核及扣帶回等區(qū)的陽性表達情況。陽性標記物為棕褐色，用MIS2000圖像分析系統(tǒng)進行標記細胞書的測定及積分光密度測定。

1.5 統(tǒng)計學方法

實驗數據以均值±標準差(Mean±SD)表示，組間差異采用ANOVA進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 治療后各組行為學檢測結果

Morris水迷宮實驗檢測大鼠空間學習記憶能力，在隱藏平臺獲得實驗中，各組動物的逃避潛伏期均隨游泳次數增多而減少，波形呈鋸齒狀，說明動物對前次的學習有遺忘。第8天撤除目標象限臺子，進行空間搜索實驗，計算大鼠在目標象限停留時間百分比和所游距離的百分比，用來檢測記憶力保持能力。結果顯示，DM模型組游泳距離的百分比也最短(19.55±3.47%)，在目標象限停留時間百分比最短(26.77±3.56%)，說明糖尿病組動物存在明顯的空間學習記憶障礙，針刺治療后動物在目標象限停留時間(34.44±5.48%)和所游的距離(24.69±4.37%)明顯優(yōu)于 DM 模型組(表 3、4)，其P值均小于0.05。

2.2 免疫組織化學結果

表3 各組動物治療后游泳距離(百分比)比較

表4 治療后游泳時間百分比

CREB免疫組化陽性標記細胞分布于廣泛的腦部區(qū)域，標記細胞胞漿內充滿棕黃色的陽性反應顆粒，胞核不著色，海馬區(qū)域的標記神經元最多(圖1)，著色最深，體積為中等大小最多，形狀均為圓形，樹突無染色。表5顯示，4組海馬陽性標記物細胞比較，正常組 NC最高，ACP組次之，BD組再次之，DM組最低，前3組與DM組比較有顯著性差異(P<0.05)。標記物光密度比較，正常組 NC最高，ACP組次之，BD組再次之，DM組最低，前3組與DM組比較有顯著性差異(P<0.05)。表6顯示，杏仁核的CREB陽性標記物與海馬區(qū)域數量較少，標記也較淺，標記物光密度比較，正常組 NC最高，ACP組次之，BD組再次之，DM組最低，前3組與DM組比較有顯著性差異(P<0.05)。

圖1 海馬出現CREB陽性表達的神經元。NC:正常組，AP:針灸治療組，BD:BDNF治療組，DM:糖尿病模型對照組

3 討論

糖尿病(diabetesmellitus，DM)是常見的內分泌代謝性疾病。流行病學研究結果顯示，老年性癡呆與2型糖尿病的發(fā)病率均呈現逐年上升態(tài)勢，二者具有明顯相關性[1、2]。DM引起的腦功能障礙是一個多因素的病理過程，可引起血管功能和結構的損傷，導致血流的改變而加重腦缺血，增加中風的死亡率，對由此導致的學習記憶障礙也沒有很好的治療方法。以往的研究表明，針刺療法對糖尿病神經病變和腦缺血都具有良好的療效[3]，與針刺能改善微循環(huán)、緩解組織缺氧有關，調節(jié)海馬內神經生長因子的表達，也與針刺能夠直接或間接地影響中樞神經系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)及周圍神經系統(tǒng)有關[4，5];針灸結合減量西藥可以較理想地控制2型糖尿病患者的血糖、血脂，既減少了藥物帶來的副反應，又可以預防血管病變引發(fā)的并發(fā)癥的發(fā)生，因而得到廣泛的臨床應用，但其作用機制有待進一步探討。

表5 治療后各組海馬CREB陽性標記物光密度值比較

表6 治療后各組杏仁核CREB陽性標記物管密度值比較

CREB(環(huán)磷腺苷反應元件結合蛋白)是轉錄因子家族中的一員。CREB磷酸化后調控神經營養(yǎng)因子的表達及其誘導的基因轉錄，增加轉錄速度，改變基因表達在各種應激性腦損傷，通過表達有效存活因子，在組織細胞修復、再生中起重要作用。CREB也具有調節(jié)包括學習記憶在內的廣泛的生物學功能[6]，是細胞內多種信號通路的一種關鍵成分。目前大量研究已表明，細胞內構成長期記憶的變化需要依賴CREB的轉錄，CREB是長期記憶形成過程所必需的一種關鍵的調節(jié)分子。學習記憶行為訓練前向大鼠海馬內注入CREB的反義寡核苷酸可導致其在Morris水迷宮中的空間學習缺陷，而訓練前雙側穹隆海馬傘被切斷的大鼠，也可因海馬CREB的水平不能升高而致逃避性記憶受損。Nagakura等[7]發(fā)現，癡呆大鼠在水迷宮訓練后逃避潛伏期延長，海馬等腦區(qū)的 CREB的含量有所下降。Herdegen等[8]用免疫組化方法觀察了大鼠大腦皮層中包括CREB在內的多種轉錄因子的表達，發(fā)現CREB與早期基因(immediate-early genes，IEGs)的編碼的核蛋白不同:IEGs受刺激誘導可以快速表達合成出新的蛋白發(fā)揮轉錄因子或轉錄調節(jié)因子的作用，而CREB受刺激后并無新的合成，只需要通過活化原有的CREB發(fā)揮作用。細胞內CREB有2種存在形式:單體和二聚體，CREB二聚體的 DNA親和力與轉錄活性均明顯高于單體，其間可以相互轉化。CREB二聚體又依其磷酸化程度分為無磷酸化、半磷酸化和磷酸化的二聚體。第1種與內源CRE親和力較低，無轉錄活性;第2種有一定DNA結合活性，但轉錄調節(jié)活性很低;只有第3種的親和力和轉錄活性作用均較高，所以一般認為，前2種為CREB的無活性形式，而第3種為 CREB的活性形式[8]。由此不難推測，磷酸化與脫磷酸化是調節(jié)CREB活性的重要機制之一。目前，研究最多CREB磷酸化的蛋白激酶是 PKA，它可使 CREB的 Ser-133位磷酸化。PKA-CREB信號轉導通路在中樞神經系統(tǒng)中起著關鍵的作用，能促進神經細胞的存活、再生和分化。實驗證明，PKA-CREB信號傳導通路與突觸的可朔性及學習記憶功能有密切的關系[9]。我們也觀察到，DM學習記憶障礙模型大鼠海馬及杏仁核內CREB表達降低，針刺可使其升高。我們的結果顯示，CREB免疫組化陽性標記神經元的體積比BDNF陽性標記細胞小，海馬區(qū)域的標記神經元最多，著色最深，體積也為中等大小最多，形狀均為圓形，樹突無染色，在陽性標記物細胞數量上ACP組與DM組比較有顯著性差異，標記物光密度比較有顯著性差異，證實海馬和杏仁核參與了針刺調節(jié)CREB的表達。

近年來發(fā)現，蛋白激酶A-cAMP反應元件結合蛋白(protein kinase A-cAMP reponse elment binding protein，PKA-CREB)信號轉導通路在中樞神經系統(tǒng)中起著關鍵的作用，能促進神經細胞的存活、再生和分化。實驗證明，PKA-CREB信號轉導通路與突觸的可朔性及學習記憶功能有密切的關系[10]。隨著腦缺血分子機制的深入研究，發(fā)現急性腦缺血可以激活內源性保護機制PKA-CREB信號轉導通路。CREB被認為是在開啟從短時記憶到長時記憶的關鍵，所以可能與改善記憶力的缺乏及認知有關系。在年長的動物大腦海馬內CREB經磷酸化后，即磷酸化CREB的活動水平明顯低于年輕組的動物，而在大腦受損的年長動物的CREB活動可能提示與空間工作記憶缺乏有關。而缺血缺氧性損傷可引起海馬亞區(qū)不同形式的細胞死亡。其表現為CA1細胞凋亡，CREB磷酸化丟失。CA3區(qū) 及齒狀回顆粒細胞不發(fā)生改變，伴隨CREB磷酸化增強并且先于細胞死亡的發(fā)。這些證據表明CREB的活化對海馬神經元的存活起重要作用。

針灸治療消渴病最早見于淳于意的診籍《史記·扁鵲倉公列傳》:“齊章武里曹山跗病，臣意診其脈曰:‘肺消癉也，死不治。所以知山跗病之府者，臣意切其脈，肺氣熱也。臣意未往診時，齊太醫(yī)先診山跗病，炙其足少陰脈口;又灸其少陰脈，而飲之半夏丸?！边@是最早循經脈用以灸法治療消渴病的病案記錄。晉·皇甫謐的《針灸甲乙經》記錄了大量具有治療消渴病主要癥狀的腧穴，如腕骨、意舍、然谷、承漿，太溪主治“消渴”、“消癉”;魚際、少商、曲池、隱白、勞宮、中封、太沖、行間等治療消渴病以渴或嗜飲為主的癥狀，而治療消渴病熱中消谷善饑主要選取足三里，指出足三里主“消中”。《甲乙經》卷七第一下:“邪在脾胃，則病肌肉痛。陽氣有余，陰氣不足，則熱中善饑，三里主之?！?0世紀50年代開始針刺治療糖尿病出現了個案報道，隨后在60年代出現大樣本的病歷觀察和分析，在80年代多以針刺治療糖尿病并發(fā)癥和針刺作用機理為研究的重點。針刺治療可以促進腦內源性BDNF蛋白的合成，可能也是針刺有效治療缺血性腦損傷的機制之一。王俊英等[11]觀察用電針鎮(zhèn)痛的累積效應與大鼠下丘腦、海馬蛋白激酶A表達的變化，推測電針鎮(zhèn)痛的積效應可能與下丘腦、海馬細胞PKA的表達上調有關，并且與動物神經記憶有密切關系。電針能有效地逆轉抑郁大鼠海馬PKA、PKC的陽性表達。認為電針對治療抑郁可能是通過調節(jié)海馬細胞信號轉導通路相關酶的功能而實現的。

本文的研究結果證實，DM學習記憶障礙模型大鼠海馬及杏仁核內CREB表達降低，針刺可使其升高。針刺可能通過調節(jié)PKA-CREB信號通路促進BDNF的合成及分泌，促進神經細胞再生功能，從而可影響學習與記憶。這可能是針刺治療老年癡呆的神經機制。

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