呂俊海，李 敏，劉 紅，仝小林，于友華，孫明杰△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

本研究以痰(濕)熱互結(jié)和熱盛傷津型2型糖尿病患者為研究對(duì)象，采用基因芯片技術(shù)，考察兩種證型2型糖尿病患者與正常對(duì)照組以及兩種證型之間的外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因表達(dá)譜特征，為從中發(fā)現(xiàn)和闡明在相應(yīng)證型Ⅱ型糖尿病的發(fā)病及進(jìn)展中起關(guān)鍵作用的基因及信號(hào)通路打下基礎(chǔ)，并為中醫(yī)診斷和治療該疾病提供精確的現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

20名受試者被納入本研究。10名為2型糖尿病痰熱互結(jié)型 (A組)，平均年齡為41.7歲;4名為 Ⅱ型糖尿病熱盛傷津型(B組)，平均年齡為44.5歲;6名為年齡和性別匹配的正常對(duì)照(C組)，平均年齡為38.3歲。2型糖尿病西醫(yī)診斷符合1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。各證型的中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)國(guó)家《糖尿病中醫(yī)防治指南》及 SFDA《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》證型診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 樣品制備

抽取每名受試者8ml全血置于含0.1ml 1%肝素抗凝管中，采用 Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，用 TRIzol(Invitrogen)試劑抽提 PBMC RNA并用 RNeasy Mini Kit(QIAGEN)純化，采用分光光度計(jì) (Nanodrop ND-1000)和1%瓊脂糖凝膠電泳評(píng)價(jià) RNA的質(zhì)量和完整性。隨后采用基于 T7擴(kuò)增方法取1μg RNA進(jìn)行線性擴(kuò)增，其余存放于－80℃冰箱中以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中進(jìn)一步用 Cy3(Ambion Amino Allyl MessageAMPⅡaRNA labeling kit)標(biāo)記 aRNA。

1.3 芯片雜交

標(biāo)記后的 aRNA純化后與芯片(Human OneArrayTMmicroarray)雜交，42℃雜交箱中避光雜交18h后用 1×SSC/0.2%SDS洗滌 10min，0.1×SSC/0.2%SDS洗滌 10min，重復(fù)2次，0.1×SSC洗片5min，重復(fù)2次。每樣品做2個(gè)雜交重復(fù)。

1.4 掃描和分析

最后在Axon GenePix 4000B掃描儀獲取圖像，使用GenePix pro V6.0軟讀取圖像初始信號(hào)值。信號(hào)值和信噪比(SNR)均大于0的基因進(jìn)入下一步分析。用 Expander軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(Quantile Normalization)處理后，采用倍數(shù)變化(≥1.5)，和 t檢驗(yàn)方法(P≤0.05)篩選兩組樣本間的差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取質(zhì)量

所提取的20例全血樣品PBMC的RNA的A260/A280均位于1.97和2.02之間，A260/A230均大于 1.95，說(shuō)明 RNA的純度很高。RNA電泳28S與18S條帶清晰，亮度較高(見(jiàn)圖 1)，證實(shí)所有標(biāo)本的RNA滿足芯片實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 基因芯片結(jié)果

2.2.1 圖2為3組樣本PBMC基因表達(dá)譜的散點(diǎn)圖，圖中的點(diǎn)絕大部分集中在比值為 1的斜線周圍，各組間信號(hào)強(qiáng)度R值接近于1，說(shuō)明各組芯片雜交的信號(hào)強(qiáng)度一致性很好。

2.2.2 差異表達(dá)基因

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳

圖2 雜交信號(hào)強(qiáng)度組間比較散點(diǎn)圖X軸和Y軸均為信號(hào)強(qiáng)度的log2值

根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)(表達(dá)差異倍數(shù)大于1.5，P值小于0.05)，將這3組樣本表達(dá)譜分別進(jìn)行比較。A組與C組相比，共有72條差異基因，其中7條為上調(diào)，65條為下調(diào);B組與 C組相比，共有23條差異基因，其中13條為上調(diào)，10條為下調(diào);A組與 B組相比，共有85條差異基因，其中22條為上調(diào)，63條為下調(diào)。表1～3列出部分各組間差異基因、編碼蛋白或功能以及其在染色體上定位。從所得數(shù)據(jù)中還可看出基因ART1在B組中表達(dá)較A組和C組都高;基因KIAA1984和TRA2A在A組和B組中表達(dá)均低于 C 組;基因 CTSL、CYLD、IGSF4C、MDS009、PTPN2、RBM13和STK16在A組中表達(dá)較B組和C組均為低;基因C9orf127在 A組表達(dá)高于 C組，而在B組表達(dá)低于C組。

表1 A組與C組比較部分表達(dá)差異基因

表2 B組與C組比較部分表達(dá)差異基因

表3 A組與B組比較部分表達(dá)差異基因

3 討論

2型糖尿病在中醫(yī)學(xué)該病屬于消渴病范疇，其早中期中醫(yī)證候以痰(濕)熱互結(jié)、熱盛傷津、氣陰兩虛為主［4、5］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，多個(gè)基因變異與環(huán)境因素的影響共同決定該病的易感性。我們以西醫(yī)糖尿病為基礎(chǔ)，利用芯片技術(shù)，考察痰(濕)熱互結(jié)、熱盛傷津型病人在表達(dá)譜上的特征，為其證候生物學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行有益的探索，同時(shí)對(duì)確認(rèn)中藥的作用靶點(diǎn)及闡明糖尿病發(fā)病機(jī)理提供理論依據(jù)。

研究結(jié)果顯示，2種不同證型的2型糖尿病組分別與正常對(duì)照組相比較，所得差異表達(dá)基因種類和數(shù)目大為不同，同時(shí)兩類患者的基因表達(dá)也有明顯差異，說(shuō)明痰(濕)熱互結(jié)和熱盛傷津型2型糖尿病在基因表達(dá)水平上有著質(zhì)的區(qū)別，提示中醫(yī)證候的區(qū)分應(yīng)有其分子水平物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因編碼產(chǎn)物的生物學(xué)功能及相關(guān)信號(hào)通路的進(jìn)一步研究，可為闡明中藥的作用位點(diǎn)和指導(dǎo)對(duì)相應(yīng)中藥的篩選及評(píng)價(jià)提供現(xiàn)代分子生物學(xué)依據(jù)。

基因TRA2A和BLVRA在A組和B組中表達(dá)均低于C組。TRA2A的編碼蛋白調(diào)控著轉(zhuǎn)錄后RNA的編輯，使之釋出不同蛋白變體，它的表達(dá)量下降有可能使得某些基因產(chǎn)物的缺乏，從而促進(jìn)了糖尿病的發(fā)生和病理發(fā)展過(guò)程。BLVRA、膽綠素還原酶A是將膽紅素轉(zhuǎn)化為膽綠素的重要酶。膽綠素被證實(shí)是很重要的生理性氧自由基清除劑，被認(rèn)為是最佳的抗自由基物質(zhì)［3］。慢性高血糖狀態(tài)以及游離脂肪酸(FFA)增高均可造成氧化應(yīng)激的增強(qiáng)，使單核細(xì)胞產(chǎn)生的 ROS增多，促炎癥轉(zhuǎn)錄因子NFκB活性增強(qiáng)，從而產(chǎn)生一系列促炎癥反應(yīng)，這對(duì)于糖尿病的繼發(fā)損傷和并發(fā)癥的產(chǎn)生與發(fā)展起重要作用。

基因CTSL、組織蛋白酶L參與許多特殊的生理過(guò)程，如激素原的激活、抗原呈遞等。但在病理狀態(tài)下，各種原因所致的細(xì)胞損傷導(dǎo)致溶酶體膜穩(wěn)定性降低，通透性增高甚至破裂，大量CL釋放到胞質(zhì)或組織間隙并被激活，可降解細(xì)胞成分或細(xì)胞間質(zhì)基質(zhì)成分，包括層黏素、IV型膠原纖維及纖維連接素等，與人類許多疾病有關(guān)［4］?；?CYLD編碼一種蛋白酶，具有內(nèi)源性泛素酶活性，其在調(diào)節(jié) NF-kappa-B活化相關(guān)通路中起重要作用，如影響細(xì)胞生長(zhǎng)、微管蛋白穩(wěn)定性、自身免疫等等;這種蛋白發(fā)揮正常功能需要正常的細(xì)胞因子環(huán)境支持［5］。

在A組中，與免疫有關(guān)的基因，如 IL-15和IGSF4C表達(dá)量低于另2組，提示A組患者的免疫功能低下更為明顯。加之與B組相比，A組下調(diào)基因數(shù)量遠(yuǎn)多于B組，也就是說(shuō)該組患者細(xì)胞功能下降更明顯。

綜上所述，痰(濕)熱互結(jié)、熱盛傷津型2型糖尿病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)譜較正常對(duì)照人群各有其特征性改變;這2種證型患者基因表達(dá)差異也很明顯，涉及細(xì)胞代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、離子通道與運(yùn)輸?shù)鞍?、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄因子等多條通路基因。

［1］ 趙天豫，段軍，仝小林.中醫(yī)治療糖尿病的新思路［J］.光明中醫(yī)，2002，17(5).

［2］ 牟新，周旦陽(yáng)，趙進(jìn)喜.糖尿病腎病中醫(yī)證候量表的研制方法探討［J］.中華中醫(yī)藥雜志(原中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào))，2007，22(11).

［3］ 邢邯英，黃黛，野戰(zhàn)鷹，凌亦凌，趙曉云.不同HO-1表達(dá)水平對(duì)糖尿病模型大鼠血管舒張功能及NOS的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009，29(23).

［4］ 賀茂林，陳安民.反義表達(dá)人組織蛋白酶 L對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲特性的影響［J］.中國(guó)矯形外科雜志，2005，13(1).

［5］ Wei Jin， Mikyoung Chang， Emmanuel M. Paul，et al.Deubiquitinating enzyme CYLD negatively regulates RANK signaling and osteoclastogenesis in mice.J Clin Invest，2008，118(5):1858.