孫 剛，王笑紅，翟志光，王克林，孫 萌

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

單純皰疹病毒可分為1型和2型，主要通過(guò)皮膚和黏膜密切接觸傳播，1型皰疹病毒主要感染腰以上部位的皮膚黏膜和器官，2型皰疹病毒主要引起生殖器發(fā)炎和皰疹。皰疹病毒引起的病情反復(fù)發(fā)作，遷延難愈，從而導(dǎo)致皮膚黏膜進(jìn)一步感染，給病人造成很大的痛苦。阿昔洛韋是治療單純皰疹病毒的特效藥，但能夠引起急性腎功能損害等副作用。因此，尋找治療作用好且副作用小的藥物迫在眉睫。本文探討中藥制劑皰疹清對(duì)單純皰疹病毒(HSV)作用機(jī)理，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 Hep-2細(xì)胞由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供。

1.1.2 病毒 HSV-1、HSV-2由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究中心提供，本室傳代凍存。

1.1.3 藥物 皰疹清由英佳興業(yè)有限公司提供，批號(hào)為20040301，每克干粉相當(dāng)于8.46 g生藥;陽(yáng)性對(duì)照藥為市售阿昔洛韋(無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷)，批號(hào)031201，廣東省珠海市麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠生產(chǎn)。

1.1.4 試劑 DMEM(美國(guó)gibco公司)細(xì)胞培養(yǎng)液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板及其他實(shí)驗(yàn)材料均從吉泰科聯(lián)生物有限公司購(gòu)買(mǎi)。

1.1.5 動(dòng)物 昆明種小鼠，體重14g～16g，雌雄各半，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供，合格證號(hào)分別為SCXK(京)-001和 SCK(京)-006，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所動(dòng)物室(清潔級(jí))飼養(yǎng)。

1.2 步驟

1.2.1 體外實(shí)驗(yàn) 皰疹清對(duì)Hep-2細(xì)胞半數(shù)中毒濃度(CC50)測(cè)定:向96孔培養(yǎng)板各孔加入100(I生長(zhǎng)旺盛的 Hep-2細(xì)胞懸液，使每孔中含有104個(gè)細(xì)胞。置細(xì)胞培養(yǎng)板于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)成單層后向板內(nèi)加入倍比稀釋的皰疹清溶液，設(shè)細(xì)胞對(duì)照，72 h后用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞病變(CPE)，用 Reed-Muench法算出藥樣對(duì)細(xì)胞的50%細(xì)胞中毒濃度(CC50)，以無(wú)毒濃度用于進(jìn)行抗病毒實(shí)驗(yàn)。

皰疹清對(duì) HSV-1、HSV-2感染 Hep-2細(xì)胞模型半數(shù)有效濃度(EC50)測(cè)定[1、2]:向 96 孔培養(yǎng)板各孔加入100(l生長(zhǎng)旺盛的Hep-2細(xì)胞懸液，使每孔中含有104個(gè)細(xì)胞。置細(xì)胞培養(yǎng)板于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)成單層后將100個(gè) TCID50的病毒液100(l加入除正常細(xì)胞對(duì)照外的各孔中，置細(xì)胞培養(yǎng)板于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中，2h后棄去病毒液，再向細(xì)胞培養(yǎng)板中加入倍比稀釋的對(duì)細(xì)胞無(wú)毒的皰疹清溶液。并設(shè)正常對(duì)照、病毒感染對(duì)照及阿昔洛韋陽(yáng)性對(duì)照，置細(xì)胞培養(yǎng)板于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)。細(xì)胞無(wú)病變記作“－”，25%以下的細(xì)胞出現(xiàn)病變記作“+”，25% －50%的細(xì)胞出現(xiàn)病變記作“++，50% ～75%的細(xì)胞出現(xiàn)病變記作“+++”，75% ～100%的細(xì)胞出現(xiàn)病變記作“++++”，“+”和“－”視為CPE陰性，其余視為CPE陽(yáng)性。

1.2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) HSV-1、HSV-2感染昆明小鼠LD50測(cè)定:選用正常健康14g～16g昆明小鼠，隨機(jī)分為6組，設(shè)正常對(duì)照組，雌雄各半。各組小鼠接受 10倍比稀釋的病毒懸液 0.02ml顱內(nèi)注射[3－4]，觀察記錄14 d各組動(dòng)物的存活數(shù)量，計(jì)算造成小鼠半數(shù)死亡的病毒濃度。

皰疹清對(duì)HSV-1、HSV-2型感染昆明小鼠死亡率影響:將小鼠隨機(jī)分成皰疹清大劑量、中劑量、小劑量組、阿昔洛韋陽(yáng)性對(duì)照組、模型組、生理鹽水對(duì)照組。將單純皰疹病毒1型和2型分別以100個(gè)LD50腦內(nèi)注射0.02ml感染小鼠，空白對(duì)照組腦內(nèi)注射0.02ml生理鹽水。24h后開(kāi)始灌胃給藥治療。小鼠的治療劑量分別為人臨床用量的22倍、11倍、5.5倍，折算成小鼠用量高、中、低分別為0.884 g/kg.d、0.442 g/kg.d和 0.221 g/kg.d。陽(yáng)性對(duì)照藥阿昔洛韋0.1g/kg.d給藥;空白對(duì)照組及模型組分別灌胃生理鹽水，每只0.2ml，連續(xù)給藥7日。觀察記錄給藥后14d內(nèi)各組小鼠的生存時(shí)間和生存數(shù)量。

1.2.3 結(jié)果計(jì)算 體外實(shí)驗(yàn)用Reed-Muench法計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(CC50)和藥物抗病毒半數(shù)有效濃度(EC50)。

2 結(jié)果

2.1 體外實(shí)驗(yàn)

2.1.1 皰疹清對(duì)HEP-2細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(CC50)的結(jié)果 表1顯示，皰疹清原濃度為100mg/ml。按1.2.1方法將皰疹清用DMEM維持液倍比稀釋7個(gè)濃度，測(cè)定其對(duì)實(shí)驗(yàn)所用 Hep-2細(xì)胞的CC50。

表1 皰疹清對(duì)細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(CC50)計(jì)算表

從上表可計(jì)算出皰疹清致半數(shù)細(xì)胞死亡的稀釋倍數(shù)為224倍，由此得出半數(shù)毒性濃度(CC50)為0.446mg/ml。

2.1.2 皰疹清對(duì)HSV－1感染細(xì)胞的保護(hù)作用 表2顯示，將皰疹清用DMEM液配制成亞毒性濃度以下的若干個(gè)濃度進(jìn)行抗HSV-1實(shí)驗(yàn)，方法如1.2.1所述。

表2 皰疹清對(duì)HSV-1感染細(xì)胞的保護(hù)作用

表2顯示，皰疹清對(duì)HSV－1感染細(xì)胞50%保護(hù)率稀釋倍數(shù)為1280，得出皰疹清對(duì)HSV-1感染細(xì)胞保護(hù)作用的 EC50為0.078mg/ml，TI為5.7。

2.1.3 皰疹清對(duì)HSV-2感染細(xì)胞的保護(hù)作用將皰疹清用DMEM液配制成亞毒性濃度以下的若干個(gè)濃度進(jìn)行抗HSV-2實(shí)驗(yàn)，方法如1.2.1所述。

表3 皰疹清對(duì)HSV-2感染細(xì)胞的保護(hù)作用

表3顯示，皰疹清濃度在0.04217mg/ml時(shí)，對(duì)HSV-2的抑制率即對(duì)感染細(xì)胞的保護(hù)率為50%，TI為10.6。

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 皰疹清對(duì)HSV-1致小鼠腦炎(HSE)治療作用觀察 表4顯示，模型組小鼠全部死亡，而中劑量存活率高達(dá)50%，其他2組存活率也有不同程度的提高;生存時(shí)間上中劑量組平均為9.81 d，與模型對(duì)照組比較 P<0.01;大劑量生存天數(shù)平均為8.63 d，和模型對(duì)照組比較 P<0.05，表明此藥對(duì)單純皰疹病毒1型引起的小鼠腦炎有較好的療效。

表4 皰疹清對(duì)HSV-1致小鼠腦炎治療作用結(jié)果

2.2.2 皰疹清對(duì)HSV-2引起小鼠腦炎治療作用觀察 表5顯示，給藥各組中中劑量組存活率為22%，大劑量組存活率為11%，而模型組全部死亡;中劑量組和大劑量組生存天數(shù)平均分別為9.28d和8.39d，小鼠生存天數(shù)和模型組比明顯延長(zhǎng)，中劑量組和模型組比較P<0.01，大劑量組和模型組比較P<0.05，表明此藥對(duì)單純皰疹2型病毒引起的腦炎有一定的療效。

表5 皰疹清對(duì)HSV-2引起小鼠腦炎治療作用結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 皰疹清抗HSV-1實(shí)驗(yàn)結(jié)果

皰疹清在體外抗HSV-1型實(shí)驗(yàn)中EC50為0.078mg/ml，TI=5.7;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)皰疹病毒1型引起小鼠腦炎的小鼠治療作用中，生存率明顯提高，生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，與模型組比較有顯著差異，由此可以判斷出皰疹清對(duì)皰疹病毒1型有較強(qiáng)的抑制作用。

3.2 皰疹清抗HSV-2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

皰疹清在體外抗HSV-2型實(shí)驗(yàn)中EC50為0.042mg/ml，TI=10.6;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)皰疹病毒2型引起小鼠腦炎的小鼠治療作用中，生存率有所提高，生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，與模型組比較有顯著差異，由此可以判斷出皰疹清對(duì)皰疹病毒2型有較強(qiáng)的抑制作用。

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，皰疹清對(duì)單純皰疹病毒有較好的療效，此藥作為中藥制劑較合成藥具有副作用小的優(yōu)點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。

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