賓 馳 顏棟林

（1 浦北縣人民醫(yī)院，廣西 浦北 535300；2 廣西南寧食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530001）

藥品微生物限度檢查是控制醫(yī)院制劑質(zhì)量的一項(xiàng)重指標(biāo)，為了保證測定方法的可靠性，必須按照中國藥典2005年版的規(guī)定[1]進(jìn)行方法驗(yàn)證。本文根據(jù)制劑抑菌活性的強(qiáng)弱和對(duì)不同菌種抑菌程度的大小采用適當(dāng)?shù)臋z查方法，加入5種污染菌：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌于4種制劑中，對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率進(jìn)行驗(yàn)證，并以加入4種污染菌：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單細(xì)胞、沙門菌進(jìn)行檢出實(shí)驗(yàn)，從而建立4種醫(yī)院制劑的微生物限度檢查方法。

1 材 料

1.1 樣 品

①外用跌打酒（批號(hào)：071128，071202，071210）、（2）跌打洗液（批號(hào)：071130，071201，071202）、③膽貝蜜汁口服（批號(hào)：071201，071204，071207）、④解毒抗白顆粒（批號(hào)：081001 ，081002，081003），均由南寧市中醫(yī)院提供。

1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL），改良馬丁培養(yǎng)基，改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，MUG培養(yǎng)基，曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，溴化十六烷三甲胺瓊脂培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基，沙門、志賀菌屬培養(yǎng)基，由廣西食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.3 試驗(yàn)菌株

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌（Escherichia coli） [CMCC（B）44102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、沙門菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC（B）50094]，由廣西食品藥品檢驗(yàn)所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門菌、銅綠假單胞菌取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，白色念珠菌取經(jīng)25℃培養(yǎng)24～48h的改良馬丁液體培養(yǎng)物，黑曲霉取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物加10mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子所得菌液，用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。

2.2 供試液的制備

液體制劑取原液或固體制劑取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，搖勻，成1:10均勻混懸液作為供試液。常規(guī)法：取供試液1mL注皿。

培養(yǎng)基稀釋法：（1） 取供試液1mL注入2個(gè)平皿（0.5mL/皿）

（2） 取供試液1mL注入5個(gè)平皿（0.2mL/皿）

薄膜過濾法：取供試液1mL，采用薄膜過濾法，依法檢查，以0.1%蛋白胨水為沖洗液。

2.3 回收率測定

試驗(yàn)組：取供試品原液（或1∶10）1mL注入平皿，每個(gè)平皿分別加入上述備用的試驗(yàn)菌50～100CFU，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，待凝固后，置規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h。

表2 3批樣品的試驗(yàn)菌回收率

表3 消除供試品抑菌活性控制菌檢查方法驗(yàn)證

表4 4種醫(yī)院制劑微生物限度檢查法

菌液組：取試驗(yàn)菌50～100CFU注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，待凝固后，置規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h，測定所加入的試驗(yàn)菌數(shù)。

供試品對(duì)照組：取供試品原液（或1∶10）1mL注入平皿，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h，測定供試品本底菌數(shù)。

2.4 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

4種醫(yī)院制劑各取3個(gè)批號(hào)樣品，細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)按初步確定方法進(jìn)行加菌回收試驗(yàn)，結(jié)果5種規(guī)定試驗(yàn)菌的回收率均＞70%，符合《中國藥典》2005年版的規(guī)定，表明方法可行。結(jié)果見表2。

2.5 控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證

液體制劑取原液1mL、固體制劑取1:10混懸液10mL及50～100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基（100mL、200mL、300mL）中，依相應(yīng)的控制菌檢查法[2]進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明隨著培養(yǎng)基量的增大，制劑的抑菌活性減弱，控制菌便可檢出，說明在常規(guī)法不適用的情況下，采用培養(yǎng)基稀釋法可達(dá)到目的。結(jié)果見表3。

2.6 微生物限度檢查法建立

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建立4種醫(yī)院制劑微生物限度檢查法，結(jié)果見表4。

3 討 論

制劑的微生物限度檢查方法驗(yàn)證的目的是保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，以有效地控制制劑的質(zhì)量。我們?cè)谕ㄟ^驗(yàn)證建立方法時(shí)，應(yīng)該抱著嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，不僅要顧及檢驗(yàn)方法的科學(xué)性，還應(yīng)該遵從簡便易行的原則，避免不必要的資源浪費(fèi)。微生物限度檢查法由簡到繁的順序?yàn)槌Ｒ?guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法。在確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠前提下，能用常規(guī)法就不推薦用培養(yǎng)基稀釋和薄膜過濾法，能用培養(yǎng)基稀釋法就不用薄膜過濾法，培養(yǎng)基稀釋法能用0.5mL/皿就不必要用0.2mL/皿，薄膜過濾法每膜能用100mL沖洗就不必要用300mL。本文嚴(yán)格按中國藥典2005年版規(guī)定并遵從簡便易行的原則，通過逐步驗(yàn)證建立方法，為4種醫(yī)院制劑的微生物限度檢查法的標(biāo)準(zhǔn)制訂提供依據(jù)。

[1] ChP(中國藥典).Vol II(二部)[S].2005:Appendix(附錄)XI J 93-101