吳 巍 藺亞暉 馬瑞森 席玨敏 王 恒

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005)

引言

瘧疾是當(dāng)今世界對(duì)人類危害最為嚴(yán)重的傳染性疾病之一。全球每年約有3.5億人感染惡性瘧疾，有100～150萬(wàn)人因這一疾病而死亡，其中大多數(shù)為非洲撒哈拉以南地區(qū)5歲以下的兒童［1］。控制瘧疾的方法包括控制傳播媒介，提高診斷率和治療效果，采取疫苗預(yù)防等。目前，如何增強(qiáng)疫苗在人體內(nèi)的免疫效果是疫苗研究過程中的一個(gè)關(guān)鍵問題。

有效的紅內(nèi)期瘧疾疫苗能夠抑制裂殖子侵入紅細(xì)胞，降低瘧原蟲密度，從而減少發(fā)病率和死亡率。本課題組對(duì)紅內(nèi)期多表位疫苗的研制進(jìn)行了長(zhǎng)期的探索，前期工作借鑒了分子育種技術(shù)的隨機(jī)重組原理，利用表位改組技術(shù)構(gòu)建了多表位基因庫(kù)，并用庫(kù)免疫血清篩選出高抗原性的陽(yáng)性克隆，發(fā)現(xiàn)其中M.RCAg-1基因克隆不僅能在小鼠模型誘導(dǎo)交叉免疫保護(hù)而且能在家兔模型中誘導(dǎo)抗惡性瘧原蟲抑制性抗體［2］;D10抗原也能在家兔模型中誘導(dǎo)抗惡性瘧原蟲抑制性抗體［3］。由于以上基因均需通過表達(dá)重組蛋白后免疫，提高了疫苗的制備和保存成本，而此前在嘗試應(yīng)用核酸疫苗免疫的研究中，通過肌肉注射的免疫途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平較低，抗血清對(duì)瘧原蟲生長(zhǎng)抑制作用也不明顯，因此需要選擇新的免疫途徑。

體內(nèi)電穿孔作為一種有效的DNA疫苗遞送途徑，可以顯著地增強(qiáng)DNA疫苗在動(dòng)物體內(nèi)的免疫效果。在電場(chǎng)的作用下，細(xì)胞膜上瞬間打開一個(gè)“孔”，能夠提高目的基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的概率，從而提高表達(dá)效率。電穿孔導(dǎo)致的輕微組織損傷還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，從而提高抗原遞呈，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答［4－6］。本試驗(yàn)采用電穿孔途徑，在動(dòng)物模型中觀察 M.RCAg－1和D10作為核酸疫苗的免疫原性及D10基因抗血清對(duì)瘧原蟲生長(zhǎng)的體外抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、工具酶和試劑

6周齡的BALB/c小鼠、新西蘭大白兔(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供)，限制性內(nèi)切酶、Pfu DNA聚合酶等分子克隆工具酶(Takara公司，日本)，大量質(zhì)粒快速抽提純化提取試劑盒(Qiagen公司，德國(guó))，真核表達(dá)載體 pVAX1(Invitrogen公司，美國(guó))，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、FITC偶聯(lián)山羊抗鼠 IgG、封閉用羊血清原液和DAPI(北京中杉金橋生物公司)。

1.2 VR1012-M.RCAg-1 、pVAX1-M.RCAg-1、VR1012-D10、pVAX1-D10質(zhì)粒的構(gòu)建及制備

用PCR擴(kuò)增法分別從pDS-exM.RCAg-1和pET30a-D10(該兩個(gè)質(zhì)粒為本研究室保存)中擴(kuò)增M.RCAg-1和D10 cDNA片段，并用定向克隆法分別亞克隆入真核表達(dá)載體 VR1012、pVAX1中。經(jīng)酶切分析和DNA測(cè)序證實(shí)克隆成功。

按無(wú)內(nèi)毒素的Qiagen Mega 22500供應(yīng)商的操作說明書分別制備 VR1012、pVAX1、VR1012-M.RCAg-1 、pVAX1-M.RCAg-1、VR1012-D10、pVAX1-D10的質(zhì)粒。DNA的純度260/280 A值均為1∶1.85～1.90。分別溶于0.9% 的無(wú)菌生理鹽水中，－20℃保存待用。

1.3 電穿孔免疫

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組，BALB/c小鼠每組5只，新西蘭大白兔每組2只，通過CELLECTRA?電穿孔裝置免疫。首先分別在動(dòng)物后腿外側(cè)肌肉注射20 μL(小鼠)和50 μL(兔子)質(zhì)粒，分別采用三針式電極(小鼠)和六針式電極(兔子)，電極針插入肌肉，覆蓋注射點(diǎn)，參數(shù)為:兩個(gè)方波脈沖，恒流電流分別為0.1 A(小鼠)和0.5A(兔子)，持續(xù)52 ms，間隔時(shí)間為 1 s［7］。在第 0、2、4 周免疫，共 3 次。免疫前和每次免疫后的兩周取血，檢測(cè)特異性抗體滴度。

1.4 ELISA法檢測(cè)免疫小鼠特異性抗體水平

免疫小鼠血清中特異性抗體采用間接ELISA法檢測(cè)，包被抗原為 pDS-exM.RCAg-1和 pET30a-D10重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白M.RCAg-1和D10。3%BSA封閉后加入適當(dāng)稀釋的小鼠血清孵育，洗板后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體孵育，洗板后加底物顯色，在酶標(biāo)儀450 nm測(cè)量各孔A值。

1.5 間接免疫熒光(IFA)分析基因免疫小鼠血清對(duì)天然蟲抗原的識(shí)別情況

將惡性瘧原蟲3D7株紅內(nèi)期混合期細(xì)胞均勻涂片并固定，加入適當(dāng)稀釋的血清孵育，洗滌后加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體孵育，再洗滌后加封片劑和DAPI后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。IFA滴度的判定為陽(yáng)性結(jié)果中血清的最高稀釋度。

1.6 兔血清IgG的純化

在免疫前和免疫后的第6周收集兔血清，按照蛋白A柱說明書親合層析純化兔血清的總IgG。用PBS透析后用于體外生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)。

1.7 體外生長(zhǎng)抑制(GIA)

用山梨醇將惡性瘧原蟲3D7蟲株環(huán)狀體期細(xì)胞同步化兩次。用正常人血細(xì)胞和完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)感染紅細(xì)胞至4%懸液，分裝于96孔板內(nèi)，120 μL/孔;分別加入過濾無(wú)菌含不同濃度純化抗體，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，每孔30 μL;37℃正常蠟燭缸中培養(yǎng)48 h后，涂片，用Giemsa染色，鏡檢，計(jì)數(shù)3 000個(gè)細(xì)胞。生長(zhǎng)抑制率按下列公式計(jì)［2］:

生長(zhǎng)抑制率=［(對(duì)照組感染率－起始感染率)－(實(shí)驗(yàn)組感染率 －起始感染率)］/(對(duì)照組感染率－起始感染率)×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用 t檢驗(yàn)法檢測(cè)各組間的差異，顯著差異水平為 P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠血清中特異性抗體測(cè)定

用 30 μg/鼠 的 重 組 質(zhì) 粒 VR1012、pVAX1、VR1012-M.RCAg-1 、pVAX1-M.RCAg-1、VR1012-D10、pVAX1-D10分別經(jīng)電穿孔技術(shù)免疫 BALB/c小鼠，于免疫后2、4、6周采血，分離血清，用 ELISA法檢測(cè)血清的抗體滴度?？乖蛎庖呓M小鼠產(chǎn)生重組蛋白抗體，而載體對(duì)照組小鼠血清呈陰性反應(yīng)。在連續(xù)接種過程中，血清抗體水平隨接種次數(shù)而升高，于第3次免疫后達(dá)到最高水平。VR1012-M.RCAg-1和pVAX1-M.RCAg-1免疫組誘導(dǎo)出小鼠的抗體平均滴度均為1/102 400(見圖1)。VR1012-D10免疫組誘導(dǎo)出小鼠的抗體平均滴度為1/51 200，而 pVAX1-D10免疫組為1/102 400，兩組相比有顯著性差異(P<0.01)(見圖2)。

圖1 惡性瘧原蟲多表位DNA疫苗M.RCAg-1接種BALB/c小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體Fig. 1 Antibody responses in BALB/c mice immunizedwithmulti-epitopeDNA vaccineM.RCAg-1 of Plasmodium falciparum

圖2 惡性瘧原蟲多表位DNA疫苗D10接種BALB/c小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體Fig.2 Antibody responsesin BALB/cmice immunized with multi-epitope DNA vaccine D10 of Plasmodium falciparum

2.2 基因疫苗誘導(dǎo)血清特異性抗體對(duì)天然蟲抗原的識(shí)別情況

經(jīng)30 μg/鼠抗原基因免疫BALB/c小鼠3次后收集血清，用間接免疫熒光法分析各組小鼠血清對(duì)天然蟲抗原的識(shí)別情況。結(jié)果顯示抗血清均能識(shí)別惡性瘧3D7株感染紅細(xì)胞，VR1012-M.RCAg-1、pVAX1-M.RCAg-1組最高稀釋滴度達(dá)1/40。VR1012-D10組最高稀釋滴度達(dá)1/800，pVAX1-D10組達(dá)1/1 600。

2.3 不同免疫劑量的基因疫苗誘導(dǎo)血清特異性抗體測(cè)定

分別 用 10、30、100 μg/鼠 劑 量 的 pVAX1-M.RCAg-1和pVAX1-D10基因疫苗免疫小鼠3次后收集血清，檢測(cè)血清特異性抗體水平。發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量均能誘發(fā)特異性抗體產(chǎn)生，其中以低、中劑量組產(chǎn)生的抗體水平較高劑量組高，在低劑量和中劑量的免疫組誘導(dǎo)出小鼠的抗體滴度均為1/102 400，而高劑量組為1/51 200(見圖3和圖4)。兩組相比有顯著性差異(P<0.01)。

2.4 D10基因免疫兔純化IgG體外對(duì)瘧原蟲生長(zhǎng)的影響

用50 μg pVAX1-D10質(zhì)粒免疫大白兔，免疫3次后收集血清，檢測(cè)抗體滴度為1/102 400，純化總IgG后體外檢測(cè)IgG對(duì)3D7蟲株生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)在IgG濃度為2 mg/mL時(shí)對(duì)3D7的抑制率為45%，而且這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系(見表1)。

3 討論

圖3 不同劑量基因疫苗M.RCAg-1接種BALB/c小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體 (橫坐標(biāo)中的L、M 和H分別代表低劑量、中等劑量和高劑量)Fig.3 Antibody responsesin BALB/cmice immunized with differentimmunedosesofM.RCAg-1 DNA vaccine(L，M and H represent lowdose、 middle-dose and high-dose group，respectively)

圖4 不同劑量基因疫苗D10接種BALB/c小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體(橫坐標(biāo)中的L、M和H分別代表低劑量、中等劑量和高劑量)Fig.4 Antibody responsesin BALB/cmice immunized with different immune doses of D10 DNA vaccine(L，M and H represent low-dose、middledose and high-dose group，respectively)

表1 D10基因疫苗免疫后兔血清IgG體外對(duì)3D7蟲株生長(zhǎng)的影響Tab.1 Evaluation of inhibitory activities against 3D7 of D10 DNA vaccine-elicited antibodies in vitro

選擇優(yōu)化的表達(dá)載體可以提升抗原的表達(dá)效率，從而提高疫苗的免疫效果。本研究選用真核表達(dá)載體pVAX1和VR1012分別對(duì)M.RCAg-1和D10基因進(jìn)行表達(dá)。這兩種載體的共有特點(diǎn)是都用卡那霉素抗性篩選基因，減少抗性篩選基因和人類基因組發(fā)生重組的可能性;強(qiáng)啟動(dòng)子 pCMV和 BGH poly A信號(hào)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)重組蛋白。此外，pVAX1是由美國(guó)食品和藥品管理委員會(huì)(FDA)推薦的唯一可以應(yīng)用于人體實(shí)驗(yàn)的載體質(zhì)粒，具有更高的生物安全性;這一載體分子量小，表達(dá)容量大［8］。本實(shí)驗(yàn)研究證明M.RCAg-1基因在pVAX1中表達(dá)的免疫效果與VR1012相同。而D10基因在pVAX1中的表達(dá)的免疫效果優(yōu)于VR1012，所以在劑量摸索的試驗(yàn)中應(yīng)用pVAX1表達(dá)載體。

免疫劑量是影響免疫效果的另一重要因素。過高的免疫劑量不但不能提高機(jī)體的免疫效果，反而會(huì)產(chǎn)生免疫抑制，同時(shí)也會(huì)增加經(jīng)濟(jì)投入。反之，劑量過小，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答［9］。為了尋找 M.RCAg-1和 D10基因疫苗的最佳免疫劑量，本實(shí)驗(yàn)分3個(gè)劑量組(10，30，100 μg)免疫。結(jié)果證明 10 μg/鼠的劑量就足夠誘導(dǎo)1/102 400的抗體滴度，增加免疫劑量到 30 μg/鼠時(shí)也不會(huì)使抗體滴度繼續(xù)增加，當(dāng)抗原過量達(dá)到100 μg/鼠時(shí)還會(huì)抑制抗體的產(chǎn)生。

對(duì)DNA疫苗進(jìn)行優(yōu)化還包括采用高效的基因遞送途徑。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明體內(nèi)電穿孔的免疫途徑可以減緩肌細(xì)胞的周轉(zhuǎn)率，從而延長(zhǎng)抗原的生成時(shí)間［6］。因此，體內(nèi)電穿孔作為肌肉注射的一種重要的輔助方法顯示出了良好的應(yīng)用前景，并可以增強(qiáng)DNA疫苗在多種動(dòng)物中的免疫原性［4-6］。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果顯示，肌肉注射 VR1012-M.RCAg-1基因疫苗 100 μg/鼠可誘導(dǎo)1/1 600的抗體滴度［10］，而本實(shí)驗(yàn)通過電穿孔的傳遞方法免疫VR1012-M.RCAg-1基因疫苗10 μg/鼠即可誘導(dǎo)1/102 400的抗體滴度，可見電穿孔方法免疫可以提高基因的免疫效果。而且pVAX1-D10基因免疫兔血清IgG在濃度為2 mg/mL時(shí)對(duì)3D7的抑制率是45%，這個(gè)結(jié)果與本試驗(yàn)室前期用D10重組蛋白免疫結(jié)果接近［3］?？梢姂?yīng)用電穿孔方法傳遞DNA疫苗同樣可以誘導(dǎo)抗惡性瘧生長(zhǎng)的抗體，而且制備和純化更加方便，是一種理想的基因遞送途徑。

4 結(jié)論

影響DNA疫苗的免疫效果的因素很多，如基因的表達(dá)載體、接種方式和免疫劑量等。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，電穿孔的免疫途徑與傳統(tǒng)的肌肉注射方法相比提高了基因的免疫效果，同時(shí)還減少了免疫劑量。對(duì)于D10基因，pVAX1表達(dá)載體的免疫效果優(yōu)于VR1012載體，為今后D10基因疫苗的研究提供更好的表達(dá)載體。在劑量的摸索中發(fā)現(xiàn)10 μg/鼠是最佳的免疫劑量。M.RCAg-1和D10的DNA疫苗的免疫血清均可識(shí)別惡性瘧天然蛋白，并且D10基因免疫血清IgG在體外對(duì)惡性瘧的生長(zhǎng)進(jìn)行抑制。另外，還有其他的方法可以提高DNA疫苗的免疫效果，需要在以后的工作中進(jìn)行更多的研究。

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