姬宏莉，姬宏娟，馬永全，杜 芳，王 輝

腫瘤的發(fā)生不僅取決于核內(nèi)遺傳物質(zhì)，而且還與核外的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）密切相關(guān)[1，2]。mtDNA是細胞內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì)，具有可自主復(fù)制的DNA基因組。mtDNA是具有編碼區(qū)和非編碼區(qū)共16 569個堿基對的雙鏈閉環(huán)分子，其中編碼區(qū)含有37個基因，2種rRNA，22種tRNA和13種與線粒體氧化磷酸化有關(guān)的蛋白多肽基因；非編碼區(qū)由 1120bp（16025-576）的 D環(huán)（D-Loop）構(gòu)成[3]。多項研究發(fā)現(xiàn)mtDNA的D環(huán)可能為mtDNA突變的熱點所在,但不同的實體腫瘤，有關(guān)該區(qū)突變的頻率報道存在明顯差異[4]。本實驗通過將大腸癌細胞突變的mtDNA片斷轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，觀察NIH3T3的突變和多態(tài)性變化，以便明確變異的mtDNA造成腫瘤發(fā)病的機制和作用。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；mtDNA提取試劑盒購自杭州V-gene生物科技公司；2×Pfu PCR MasterMix購自北京TianGene生物科技公司。Lipofection2000TM轉(zhuǎn)染試劑購自Invintrogen公司。

1.2 實驗用細胞株及質(zhì)粒 ①NIH3T3細胞株購于南方醫(yī)院病理生理教研室；②大腸癌mtDNA的重組表達載體：在 pcDNA3.1（+）載體 BamH I，Xho I位點間插入1200bp的突變的大腸癌mtDNA的D環(huán)區(qū)，命名為 pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA，pcDNA3.1（+）-Lovo mtDNA，由本課題組構(gòu)建。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) NIH3T3細胞在37℃，5%CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%進口胎牛血清（GIBCO）的DMEM高糖培養(yǎng)基，隔天換液1次，每4～5 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染與篩選 轉(zhuǎn)染前24 h將處于對數(shù)生長期的NIH3T3細胞消化計數(shù)，調(diào)整濃度為1×105個/ml，接種于六孔板中，用Lipofection2000TM將pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA、pcDNA3.1（+）-Lovo mtDNA分別導(dǎo)入NIH3T3細胞，具體轉(zhuǎn)染操作過程參考 Invintrogen公司的Lipofection2000TM說明書及相關(guān)文獻[5]。置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換無抗生素的含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，48 h后用 G418 200 μg/ml篩選，2周后挑選單克隆細胞群落，用含G418 100 μg/ml的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 mtDNA的提取 用杭州V-gene試劑公司的mtDNA提取試劑盒，采取膜裂解和膜選擇結(jié)合DNA的技術(shù)分離mtDNA。

1.3.4 PCR法擴增mtDNA D-loop 參照mtDNA D-loop的全長設(shè)計兩段引物并送上海博亞生物技術(shù)公司合成。Primer1 5’-tcgaattctttcatggggaagcaga tttgg-3’、Primer2 5’ -atggatccggaggtaagctacataaactg-3’，50 μl PCR 體 系 ：mtDNA 4 μl、Primer1 （25 μmol/L）2 μl、Primer2 （25 μmol/L）2 μl、2×MasterMix 25 μl、ddH2O 17 μl。PCR 條件：預(yù)變性 94 ℃ 3 min、以下變性 94℃ 30 s、復(fù)性 56℃ 30 s、延伸 72℃1 min共33個循環(huán)，結(jié)束延伸72℃ 5 min。并將PCR產(chǎn)物5 μl行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.5 PCR產(chǎn)物直接測序 轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒NIH3T3/Sw480-mtDNA、pcDNA3.1(+)-Lovo mtDN的序列與未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞及基因庫數(shù)據(jù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer） 相比對。當(dāng)轉(zhuǎn)染大腸癌mtDNA重組載體的NIH3T3細胞D環(huán)的核苷酸序列與NIH3T3細胞相同，但與基因庫記載的不同時，這種改變?yōu)槎鄳B(tài)性變化；當(dāng)轉(zhuǎn)染大腸癌mtDNA重組載體的NIH3T3細胞D環(huán)的核苷酸序列與基因庫記載相同，但與NIH3T3細胞不同時，這種改變?yōu)槎鄳B(tài)性變化。發(fā)現(xiàn)突變后，為除外系統(tǒng)誤差，用 PCR重新擴增線粒體 D環(huán)區(qū)，用不同的引物正反兩個方向再次測序以證實突變確實存在。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染細胞mtDNA D-loop的鑒定結(jié)果 取上述 PCR產(chǎn)物 5 μl行 1%瓊脂糖凝膠電泳，80 V，45 min，可見一條清晰的1.2 kb目的基因條帶 （圖1）。用Vilber Lourmat凝膠成像圖像分析儀分析圖像。并送上海博亞生物技術(shù)公司正反雙向測序。

2.2 轉(zhuǎn)染細胞mtDNA D-loop測序變異結(jié)果 轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA、pcDNA3.1（+）-Lovo mtDN的序列與未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞及基因庫數(shù)據(jù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer）相比對。分別檢測到轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA 的 NIH3T3細胞線粒體D環(huán)共有11個位點變化，包括5個突變，6個多態(tài)性變化，轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1（+）-Lovo mtDN的NIH3T3細胞線粒體D環(huán)共有8個位點變化，包括3 個突變，5 個多態(tài)性變化（表1、2）。

圖1 轉(zhuǎn)染前后NIH3T3細胞mtDNA D-loop電泳鑒定PCR結(jié)果

表1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Sw480 mtDNA的NIH3T3細胞線粒體D環(huán)區(qū)變化位點

表2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-lovo mtDNA的NIH3T3細胞線粒體D環(huán)區(qū)變化位點

3 討 論

腫瘤的發(fā)生都是一個多因素作用，表現(xiàn)為多階段的復(fù)雜過程。線粒體 DNA的突變在腫瘤發(fā)病中的作用和機制的研究還處在起步階段。與cDNA相比，mtDNA更加脆弱，突變率更高。近來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與線粒體DNA突變導(dǎo)致功能的改變密切相關(guān)。在大腸、肝、肺、胃等臟器以及血液系統(tǒng)的惡性腫瘤中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mtDNA的畸變[6-9]。Habano等[10]也報道了D環(huán)區(qū)的突變能引起蛋白質(zhì)合成改變，影響線粒體的功能，進而對細胞的功能產(chǎn)生影響，推測線粒體基因改變將引起其功能異常，釋放大量活性氧自由基，而這些活性氧自由基能造成核基因損傷，從而引起各種腫瘤的發(fā)生。以往的所有研究均集中在發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞或組織中存在mtDNA突變的現(xiàn)象，而mtDNA突變對腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制則涉及尚少。為進一步研究mtDNA突變與腫瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系，筆者選取NIH3T3細胞為惡性轉(zhuǎn)化的靶細胞，將突變大腸癌細胞的mtDNA轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，觀察轉(zhuǎn)染細胞mtDNA的D環(huán)區(qū)的突變情況，以進一步明確mtDNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

本研究共檢測到9個位點變化，其中16 314位T→C，75位C→T，這2個位點變化在轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒的NIH3T3細胞和NIH3T3細胞中均檢測到，考慮為多態(tài)性變化。在轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒的NIH3T3細胞中均檢測到了與正常NIH3T3細胞和基因庫記載不同的核苷酸變化，考慮為突變。在 8個突變位點中，除在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA的NIH3T3細胞線粒體DNA D環(huán)區(qū)的16 437位和16 438位間檢測插入序列G，另外的7個突變形式均為堿基置換。在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA的NIH3T3細胞中檢測到16 223位 C→T，16 225位 T→C，16 237位 C→G，16 273位C→T，211位 A→T； 在轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1 （+）-Lovo mtDN的NIH3T3細胞中檢測到 16 223位 C→T，16 225位C→T，665位C→T。因此，在轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒的NIH3T3細胞中，同時檢測到16 223位C→T，16 225位T→C，檢測到的相同的突變位點考慮為特征性改變，而這些特征性的改變目前認為可能和腫瘤的易感性有關(guān)，但是否致癌有待于進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，將大腸癌突變的線粒體 DNA導(dǎo)入到NIH3T3中，能夠誘導(dǎo)NIH3T3細胞線粒體DNA的D環(huán)區(qū)發(fā)生突變和多態(tài)性的變化，從而證實大腸癌線粒體DNA的D環(huán)區(qū)是一具有高突變性的區(qū)域，在一定程度上具有誘導(dǎo)NIH3T3細胞惡性轉(zhuǎn)化的傾向，然而在腫瘤發(fā)病中的作用和機制還需進一步研究。

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