權(quán) 華，趙靖霞，徐 錚，姜遠(yuǎn)英

近年來真菌感染率急劇上升，致病性真菌種類增多，但白念珠菌（Candida albicans）仍然是臨床最常見的致病性真菌，約占所有醫(yī)院真菌感染的50%～60%[1，2]。系統(tǒng)性白念珠菌感染病死率高達(dá)38%，是引起癌癥患者和艾滋病患者病死的主要原因。由于抗真菌藥物有限，科研工作者在不斷試圖開發(fā)新型抗真菌藥物，目前氟康唑仍然是臨床上治療白念珠菌感染的首選藥物，這是由于它具有無可替代的優(yōu)勢：生物利用度高（>90%），組織分布廣，不良反應(yīng)少，深部真菌感染療效好等。隨著氟康唑長期、大量應(yīng)用于真菌感染的預(yù)防及治療，導(dǎo)致白念珠菌耐藥性普遍產(chǎn)生，成為臨床治療失敗的主要原因[3]。為解決以上問題，抗真菌藥的聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)成為臨床抗真菌治療的發(fā)展方向之一。在筆者前期的體外實驗中，針對臨床耐藥白念珠菌0304103菌株的生長曲線實驗顯示鹽酸小檗堿與氟康唑合用的抑菌作用具有小檗堿劑量依賴性，而且體外瓊脂平板擴(kuò)散實驗、時間-殺菌曲線，以及對40株菌的棋盤式微量稀釋實驗充分證實了鹽酸小檗堿與氟康唑合用對臨床耐藥白念珠菌的協(xié)同作用[4]。因此本研究主要針對臨床耐藥白念珠菌，從動物實驗驗證了鹽酸小檗堿與氟康唑合用具有協(xié)同抗真菌作用，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 臨床耐藥白念珠菌編號0304103，由長海醫(yī)院真菌室提供，并經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。

1.1.2 藥物 氟康唑注射液（2 mg/ml）由上海信誼金朱藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，鹽酸小檗堿由上海利生制藥廠提供。氟康唑注射液、鹽酸小檗堿分別以PBS稀釋或溶解，配制用藥。

1.1.3 動物 遠(yuǎn)交系ICR小鼠90只， 雌性，6～8周，18～22 g，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，清潔級（許可證號：SCXK9(滬)2003）。

1.1.4 儀器 HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 （江蘇太倉市實驗設(shè)備廠），Biofuge stratos高速冷凍離心機(jī)（Heraeus），Leica RM2135石蠟切片機(jī) （德國 Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠系統(tǒng)性真菌感染模型的建立 從長海醫(yī)院真菌室菌液中接種臨床白念菌株0304103，在YEPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜，使其達(dá)到指數(shù)生長期末期，再活化2次，以1%接種到新鮮的YEPD 培養(yǎng)基中，即10 mlYEPD中加100 μl菌液于100 ml錐形瓶中培養(yǎng)16 h，1000×g離心5 min，用0.9%生理鹽水洗滌3次至上清液無色，去上清，以0.9%生理鹽水調(diào)至菌液濃度為5×106CFU/ml。尾靜脈注射真菌溶液0.1 ml/10 g造成ICR小鼠系統(tǒng)性真菌感染。

1.2.2 分組給藥并觀察存活時間 90只ICR小鼠隨機(jī)分為6組，15只/組，分別為真菌感染模型組（空白對照組）、氟康唑（0.5 mg/kg）單用治療組、鹽酸小檗堿（9 mg/kg）單用治療組、鹽酸小檗堿（1 mg/kg）合用氟康唑（0.5 mg/kg）治療組（簡稱合用 1組）、鹽酸小檗堿（3 mg/kg）合用氟康唑（0.5 mg/kg）治療組（簡稱合用2組）以及鹽酸小檗堿（9 mg/kg）合用氟康唑（0.5 mg/kg）治療組（簡稱合用3組）。在小鼠系統(tǒng)性真菌感染模型建立2 h后，各給藥組分別腹腔注射給藥0.2 ml/10 g，模型組（空白對照組）腹腔注射溶劑PBS0.2 ml/10 g，1次/d，連續(xù)給藥7 d。觀察小鼠死亡情況，記錄存活時間，計算每天各組存活百分率，共觀察35 d后，將存活小鼠麻醉后處死，真菌感染小鼠的尸體全部澆乙醇火燒處理。

1.2.3 腎臟活菌落數(shù)目（CFU）檢測 給藥7 d后停藥，最后一次給藥24 h后處死30只（5只/組），取雙腎臟，稱重后，剪開，以5ml 0.9%生理鹽水勻漿，再分別以0.9%生理鹽水將勻漿液稀釋103、104倍等，得到不同數(shù)量級稀釋倍數(shù)的勻漿液，各取100 μl涂鋪于SDA平皿上，于30℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計數(shù)菌落數(shù)目，以SDA平皿上生長菌落數(shù)達(dá)20個為最低限。計算腎臟活菌落數(shù)目（CFU），以log10 CFU/g 作圖，并做 Student's t test檢驗[4]。

計算公式：CFU/g=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×50/腎重量（g）。

1.2.4 腎臟組織切片病理檢查 給藥7 d后停藥，最后1 d給藥24 h后麻醉并頸部脫臼處死30只真菌感染ICR小鼠，每組5只，取腎臟，腎臟組織經(jīng)由10%中性緩沖福爾馬林液中固定、取材、酒精梯度脫水、石蠟包埋、切片，厚度10 μm，切片做HE染色（蘇木素－伊紅染色），于顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化并拍照片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 計算腎臟活菌落數(shù)目（CFU），以log10 CFU/g計算，t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 系統(tǒng)性真菌感染小鼠的治療存活時間 鹽酸小檗堿單獨(dú)治療組的平均存活時間與模型組無顯著性差異（P>0.05），分別為3.5 d和3.4 d。氟康唑單獨(dú)治療組平均存活時間9.9 d，合用1組平均存活時間為12.7 d，合用2組平均存活時間16.1 d（圖1、2），合用 3組平均存活時間 18.7 d（圖2、3）。 兩藥合用組的存活時間明顯長于氟康唑單獨(dú)治療組，其中合用2、3組與氟康唑單獨(dú)治療組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05 或 0.01）。

圖1 合用1組生存率比較線圖

圖2 合用2組生存率比較線圖

圖3 合用3組生存率比較線圖

2.2 真菌感染小鼠腎臟的活菌數(shù)檢測和腎臟組織病理檢查 腎臟的活菌數(shù)檢測換算為log10CFU/g作圖（圖4），鹽酸小檗堿單獨(dú)治療組的log10CFU/g平均值6.566與模型組6.462相比沒有顯著性差異 （P>0.05）。單獨(dú)氟康唑組活菌數(shù)平均值為5.966，合用1～3 組活菌數(shù)平均值分別為：5.723、5.645、4.967，均與單獨(dú)氟康唑組相比有統(tǒng)計學(xué)差異 （P<0.05或0.01）。尤其高劑量小檗堿與氟康唑合用組療效更好（圖4）。

圖4 腎臟中活菌數(shù)的log10CFU/g圖

2.3 腎臟病理切片HE染色 結(jié)果顯示6組小鼠均具有腎病形態(tài)特征：腎小球輕度腫脹，腎小管輕度變性腫脹，部分?jǐn)U張，間質(zhì)灶性炎癥，中性粒細(xì)胞居多，伴有灶性膿腫樣病灶形成，各組病變性質(zhì)相似，以模型組為最重，兩藥合用組最輕，其它組基本相近（圖5）。模型組為腎髓質(zhì)內(nèi)廣泛炎性病變；單用鹽酸小檗堿組腎髓質(zhì)部腎小管上皮變性壞死、脫落；單用氟康唑組腎髓質(zhì)內(nèi)有膿腫形成；合用1組腎髓質(zhì)內(nèi)有膿腫形成；合用2組腎髓質(zhì)內(nèi)有炎性病變，但未見膿腫形成；合用3組腎曲管上皮有輕微變性，但未見膿腫形成。

圖5 腎臟病理切片HE染色（10×20）

3 討 論

以編號0304103的臨床耐藥白念珠菌建立ICR小鼠系統(tǒng)性真菌感染模型，并進(jìn)行體內(nèi)實驗，研究氟康唑、鹽酸小檗堿單用以及合用對感染白念珠菌小鼠的治療情況。給藥劑量和給藥途徑均在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行預(yù)實驗后確定[5]。體內(nèi)實驗主要觀察小鼠存活時間，由于真菌感染小鼠體內(nèi)真菌在腎臟的聚集較多、損傷較重，因此筆者還檢測了腎臟內(nèi)活菌數(shù)目（CFU）以及腎臟病理變化。結(jié)果顯示兩藥合用組的存活時間明顯長于氟康唑單獨(dú)治療組，且具有劑量依賴性。兩藥合用2、3組的腎臟內(nèi)活菌數(shù)目明顯低于單藥治療組，腎臟病理切片的HE染色檢查結(jié)果顯示各組病變性質(zhì)相似，但以模型組為最重，間質(zhì)灶性炎癥伴有灶性膿腫樣病灶形成；兩藥合用組最輕，未見膿腫形成。以上結(jié)果說明氟康唑合用鹽酸小檗堿后對系統(tǒng)性真菌感染小鼠具有增強(qiáng)療效的作用，以大劑量鹽酸小檗堿合用氟康唑治療效果最佳。這種療效的增強(qiáng)，一方面是由于氟康唑與鹽酸小檗堿協(xié)同抗菌作用，另一方面小檗堿對免疫的調(diào)節(jié)作用可能也增強(qiáng)了小鼠對抗真菌感染的能力。有研究報道小檗堿能夠增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的功能可能由于小檗堿自身結(jié)構(gòu)中的季銨離子減弱了異物與細(xì)胞間的靜電斥力，使異物易與吞噬細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合而促進(jìn)吞噬作用[6，7]。

目前抗真菌藥的聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)成為臨床抗真菌治療的發(fā)展方向之一，但是現(xiàn)有的報道多局限于少數(shù)抗真菌藥物之間的聯(lián)合應(yīng)用，有關(guān)針對耐藥白念珠菌的聯(lián)合用藥報道較少，而且有些抗真菌藥物合用后反而產(chǎn)生相互拮抗的作用[8，9]，因此目前急需研究出新的安全有效的聯(lián)合用藥方案。由于臨床濫用抗生素，白念珠菌耐藥性的產(chǎn)生越來越普遍，并已經(jīng)成為臨床真菌感染治療的致命難題，本課題研究為對抗氟康唑耐藥的臨床白念珠菌提供了新思路；但其協(xié)同作用的機(jī)制仍不清楚，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。另外體外藥敏和動物實驗結(jié)果與臨床療效的相關(guān)性還是未知的，因此對于聯(lián)合用藥還需要大樣本的臨床應(yīng)用，進(jìn)行療效驗證及其可行性研究。

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