趙昌會 ，孫 佳 ，黃翔玲

（1.湖南科技學(xué)院，湖南 永州 425100；2.國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361005；3.國家海洋局海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005）

海洋中酵母菌的含量比較低，一般情況下，遠海的水體中酵母菌的濃度低于10 cells/dm3，而污染的沉積物中為100 cells/g以上，底質(zhì)中酵母菌的含量受沉積物類型的影響比較大[1]?？赏ㄟ^濃縮水樣或加富培養(yǎng)來分離酵母菌，但對于含量較少、生長較慢的酵母菌株，則需要運用特殊的富集法分離[2]。實驗室環(huán)境與自然環(huán)境的差異，加上采樣的困難，限制了人們對深海酵母菌的研究。Nagahama等[3－6]從1 000～11 000 m的深海樣品中分離到多種酵母菌，其中一些菌株與已知菌株同源性差異較大，具有研發(fā)的新潛力。本文對分離自印度洋中脊底質(zhì)的深海酵母IR08進行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 菌株IR08由黃翔玲同志采用PDA培養(yǎng)基從印度洋 IR-T3C1站（31.0877°S、59.1124°E）水深4 051 m 的洋底0～3 cm層底質(zhì)樣品中分離獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂1.5%、pH 7.0（深海海水配制）；同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.05%、酵母膏 0.02%、（NH4）2SO40.5%、KH2PO40.1%（3.4%（W/V）NaCl溶液配制）。

1.2 方法

1.2.1 深海酵母的顯微鏡觀察 挑取少量的新鮮酵母菌混勻于載玻片的無菌水中，蓋上蓋玻片，油鏡下觀察。

1.2.2 深海酵母菌的溫度和鹽度試驗 用接種環(huán)挑取少量的酵母接于鹽度分別為0、24、34、100的液體培養(yǎng)基中，分別在 4、10、25、35℃下培養(yǎng)（以不加菌液為對照），每隔24 h觀察培養(yǎng)液混濁度的變化。

1.2.3 深海酵母菌的碳代謝試驗 用接種環(huán)挑取少量酵母菌稀釋于碳源利用鑒定液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻，取0.4 cm3加到TH04酵母樣真菌鑒定板上（杭州微生物試劑有限公司），35℃搖床培養(yǎng)5 d（100 r/min）。

1.2.4 深海酵母菌DNA的提取與擴增 以酵母染色體DNA的提取為參考[7]。

1.2.5 深海酵母菌IR8的鑒定 菌株的染色體DNA 采用特異引物[8]ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3′和 LR6：5′-CGCCAGTTCTGCTTA-3′，擴增26S rDNA的D1/D2區(qū)及ITS區(qū)在內(nèi)的一段核糖體DNA。其PCR擴增反應(yīng)系統(tǒng)中包括：DNA模板 50 ng、正向及反向引物（各 10-5mol）、Taq DNA聚合酶（4 U）、2.5 mmol/μdm3的 dNTP 5 μL、5 μL 的10×PCR 緩沖液、DDW 補至 50 μL，26S rRNA 基因擴增程序：95℃預(yù)熱 4 min，94℃變性 1 min、52℃退火1 min、72℃延伸2 min，36個循環(huán)，最后 72℃ 10 min。對擴增的26S rDNA片段直接測序，測序引物選用F63、LR3；返回結(jié)果通過DNAMAN軟件處理，以此為對比目標(biāo)，通過FASTA網(wǎng)上分析搜索EMBL數(shù)據(jù)庫，尋找同源性最高菌株，采用鄰接法[7]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 IR08的菌落和菌體形態(tài)

IR08菌落淡紅色，圓形突起，較濕潤，直徑1～2 mm，易挑取。細胞卵圓形，單端芽殖（如圖1）。

圖1 IR08的細胞形態(tài)（100×）

2.2 不同溫度和鹽度對IR08生長的影響

IR08菌株受鹽度的影響較小，在25～35℃生長良好，10℃以下生長緩慢（如表1）。

表1 酵母IR08在不同時間、鹽度和溫度下的生長狀況

2.3 IR08的碳源利用特征

IR08除了能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及半乳糖外，還能利用尿素、纖維二糖、阿拉伯糖、棉子糖、肌醇和、松二糖、山梨醇等，但不能利用木醇、海藻糖、肌醇、木糖。

2.4 IR08菌株的鑒定

將26S rDNA的D1/D2區(qū)的序列測序，輸入到EMBL數(shù)據(jù)庫對比，得到rDNA分子同源性相似度最高為 Pichia guilliermondii-AY188372（98.8%），構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。

圖2 IR08的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

酵母的鑒定主要借助于生理學(xué)特征，但其碳和氮的同化實驗常表現(xiàn)易變或區(qū)別不明顯，如紅酵母屬、擲孢酵母屬、木森頓酵母屬、鎖擲孢酵母屬等，需用ITS和5.8S DNA基因序列測定、18S rDNA及26S rDNA的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的基因序列[1]，這為發(fā)現(xiàn)新種提供了良好的途徑。如Nagahama在深海底質(zhì)中發(fā)現(xiàn)新種[6]。

季也蒙畢赤酵母能在含鉻量較高的條件下生長，并將其吸收[9]、也可富集重金屬銅[10]及防治果實產(chǎn)后的腐爛[11]；分離自海洋的季也蒙畢赤酵母具有高產(chǎn)菊粉酶[12]等活性，深海分離的酵母菌IR08在環(huán)境修復(fù)及果實防腐等方面的價值有待于研究開發(fā)。致謝：

本研究在國家海洋局第三海洋研究所葉德贊研究員的實驗室完成，對他在本研究中的指導(dǎo)和支持，謹致謝忱！

[1] Nagahama T.Yeast biodiversity in freshwater，marine and deepsea environments（Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts）[J].Springer，2006，（3）:242-262.

[2] Yanagida F，Kodama K，Shinohara T.Selection of marine yeast stock for making white wine[J].J Brew Soc Jpn，2002，97:150-161.

[3] Nagahama T，Hamamoto M，Nakase T，et al.Kluyveromyces nonfermentans sp.nov.，a new yeast species isolated from the deep sea[J].Int J Syst Bacteriol，1999，49:1899-1905.

[4] Nagahama T，Hamamoto M，Nakase T，et al.Distribution and identification of red yeasts in deep-sea environments around the northwest Pacific Ocean[J].Antonie Van Leeuwenhoek，2001，80:101-110.

[5] Nagahama T，Hamamoto M，Nakase T，et al.Cryptococcus surugaensis sp.nov.，a novel yeast species from sediment collected on the deep-sea floor of Suruga Bay [J].Int J Syst Evol Microbiol，2003，53:2095-2098.

[6] Nagahama T，Hamamoto M，Horikoshi K.Rhodotorula pacifica sp.nov.，a novel yeast species from sediment collected on the deepsea floor of the north-west Pacific Ocean[J].Int J Syst Evol Microbiol，2006，56:295-299.

[7] 駱祝華，王祥敏，黃翔玲，等.熱帶太平洋深海酵母菌的多樣性與碳代謝特征研究.第三屆海洋生物高技術(shù)論壇 [C].2005：417-423.

[8] Fell J W，Boekhout T，F(xiàn)onseca A，et al.Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis[J].Int J Syst Evol Microbiol，2001，50:1351-1371.

[9] Ksheminska H，Jaglarz A，F(xiàn)edorovych，et al.Bioremediation of chromium by the yeast Pichia guilliermondii:toxicity and accumulation of Cr（III）and Cr（VI）and the influence of riboflavin on Cr tolerance[J].Microbiological Research，2003，158（1）:59-67.

[10] María-Isabel S，Luz B，Cristina A，et al.Feasibility of copper uptake by the yeast Pichia guilliermondii isolated from sewage sludge[J].Research in Microbiology，2002，153:173-180.

[11] Yan Z，Kang T，Sicong T，et al.A combination of heat treatment and Pichia guilliermondii prevents cherry tomato spoilage by fungi[J].International Journal of Food Microbiology，2010，137:106-100.

[12] Xinjun Y，Ning G，Zhenming C，et al.Inulinase overproduction by a mutant of the marine yeast Pichia guilliermondii using surface response methodology and inulin hydrolysis[J].Biochemical Engineering Journal，2009，43（3）:266-271.