郭麗 ，楊煥民 ，于志國 ，計紅 ，符亞原

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319;2.黑龍江省大慶石油管理局農(nóng)場）

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌工程菌 DH5α、BL21（DE3）由黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院分子生物學試驗室保存。pMD18-T載體質(zhì)粒購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 主要儀器及試劑

DNA回收試劑盒（上海華舜生物工程有限公司/上海華堯核酸技術(shù)有限公司）

質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校ㄉ虾ＨA舜生物工程有限公司/上海華堯核酸技術(shù)有限公司）

1.1.3 動物及采樣

產(chǎn)蛋期籽鵝5只，處死后立即采集腦垂體，液氮冷凍后，置于-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

取籽鵝腦垂體一枚（約40 mg），用Trizol法提取總RNA，并置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 RT-PCR

在 1.5mL EP 管中加入 Oligo（dT）153.0 μL，總RNA 5.0 μL，dNTP（各 10 mmoL·L-1）1.0 μL，無 RNA酶水4.0 μL；然后置于65℃水浴5min，冰浴不少于1min；再加入 5×buffer 4.0 μL，DTT （0.1 moL·L-1）1.0 μL，Reverse Transcriptase Ⅲ 1.0 μL （200 U），Rnase Inhibation 1.0 μL；50 ℃水浴 30～60min，再進行70℃水浴15min，滅活Reverse TranscriptaseⅢ。

1.2.3 PRL基因的釣取

根據(jù)NCBI發(fā)布的皖西白鵝乳素基因編碼區(qū)序列（GenBank登錄號：DQ062571），用Primer Premir 5.0設計出一對引物：

上游引物：5′-ATGGATCCATGAGCACCAAGGG GGCTTC-3′;

下游引物：5′-CCGAAGCTTTTAGCAATTGCTAT CATGTATTAG-3′。

劃線部分為BamHⅠ和HindⅢ酶切位點。由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

25μL PCR擴增體系中分別加入無RNA酶水13.35 μL，10×PCR Buffer（含Mg2+20 mmoL·L-1）2.5 μL，dNTP（各 2.5 mmoL·L-1）2.0 μL，Upper Primer 1.0 μL，Lower Primer 1.0 μL，模板 cDNA 5.0 μL，LA Taq 酶0.15 μL。擴增程序為：94 ℃ 5min，94 ℃ 30 s，57 ℃30 s，72℃ 1min，進行35個循環(huán)；72℃ 5min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳。并用試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物。

1.2.4 PRL基因克隆載體與原核表達載體的構(gòu)建

將純化回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體重組，轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。用質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖谐樘峒兓?jīng)PCR和雙酶切（BamHⅠ和HindⅢ）鑒定，將陽性鑒定的菌液送至上海Invitrogen生物有限公司（北京分部）測序。所得質(zhì)粒命名為pMD18-T-PRL。

將測序正確的克隆重組質(zhì)粒用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，釋放催乳素片段，與同樣用BamHⅠ和HindⅢ酶切的表達載體pET-32 a（+）質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)PCR及酶切鑒定正確的即為籽鵝表達質(zhì)粒pET-32a（+）-PRL。

1.2.5 誘導表達條件的優(yōu)化

將鑒定正確的pET-32a（+）-PRL質(zhì)粒和對照質(zhì)粒pET-32a（+）轉(zhuǎn)化入 DH5α，SOB 培養(yǎng)基（含 60 μg·mL-1Amp）培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時，對表達菌株分別進行 IPTG 不同終濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmoL·L-1）、誘導溫度（27、30、34、37 ℃）及誘導時間（第 2、3、4、5、6 h）進行表達條件的優(yōu)化。

1.2.6 重組蛋白在宿主菌的表達

按照1.2.5中確定的最優(yōu)誘導表達條件進行誘導表達，收集菌體經(jīng)超聲破碎，離心后分別取上清和沉淀進行12%SDS-PAGE檢測，確定目的蛋白的表達與存在形式。

1.2.7 Western blot檢測重組蛋白

將純化的融合表達蛋白和酶切后純化的單體蛋白免疫小鼠，采集小鼠血清，分別以鼠抗鵝PRL、山羊抗鼠IgG，利用Western blot方法檢測目的蛋白是否存在。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的電泳檢測

提取的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，紫外燈下觀察，可以見到完整而且清晰的電泳條帶。28S rRNA與18S rRNA的亮度比基本上呈現(xiàn)2∶1的關系，說明提取的RNA完整性比較好。用核酸基因定量儀測得OD260/OD280為1.903，紫外分光光度計測得總RNA濃度為0.63 μg·μL-1，符合反轉(zhuǎn)錄要求。

2.2 RT-PCR結(jié)果

PCR擴增后產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，長波紫外燈下觀察，出現(xiàn)約690 bp大小的特異條帶（圖1）。圖中所示PCR擴增的產(chǎn)物條帶單一，說明引物設計的特異性較好，而且成功獲得了大小約在690 bp的目的片段。

2.3 酶切鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物在連接液的作用下直接克隆到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化后挑選陽性菌落經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定（圖2）。圖中所示于約690 bp處有一亮帶，表明大小約690 bp的PRL基因cDNA片段已經(jīng)插入克隆載體中。

圖1 RT-PCR結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of RT-PCR

圖2 pMD18-T-PRL重組質(zhì)粒BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD18-T-PRL by double restriction endonuclease digestion

2.4 堿基序列與氨基酸序列分析

測序結(jié)果（GenBank編碼：FJ527782/ACL36106）同源性比對表明，籽鵝與皖西白鵝的堿基同源性是99%（688/691），與東北白鵝、番鴨、火雞、萊茵鵝的同源性分別為 100%、98%（679/690）、92%（643/694）、99%（687/691）。

氨基酸同源性分析表明，籽鵝與皖西白鵝的催乳素基因編碼的氨基酸序列的同源性在99%（228/229），與東北白鵝、番鴨、火雞、萊茵鵝的同源性分別為100%、99%（227/229）、92%（212/229）、99%（227/229）。

2.5 誘導表達條件的優(yōu)化及重組PRL基因在宿主菌中的表達

為了提高表達量，在誘導溫度、IPTG誘導濃度、誘導培養(yǎng)時間等幾個方面做了優(yōu)化表達條件的篩選。結(jié)果表明在37℃下培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時，經(jīng)終濃度為1 mmoL·L-1的IPTG誘導5 h后，其表達效果最佳，其表達量占菌體總蛋白的29.63%。但表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，降低誘導溫度至27℃并沒有發(fā)現(xiàn)增加可溶性蛋白的表達量。

將鑒定正確的pET-32a（+）-PRL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株DH5α，將宿主菌中隨機挑取單菌落接種至 SOB 培養(yǎng)液（含 60 μg·mL-1Amp）中培養(yǎng) 14 h，37℃培養(yǎng)至 OD600為 0.4～0.6時，在 1 mmoL·L-1IPTG的誘導下進行表達，誘導5 h。取出菌液用15%的Tricine-SDS-PAGE電泳系統(tǒng)進行表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，在DH5α宿主菌中可以看到有外源蛋白質(zhì)表達帶，其分子量約為45 kDa，與推測的蛋白大小一致，凝膠掃描顯示表達的蛋白約占總菌體蛋白的29.63%（圖3）。

圖3 優(yōu)化重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導表達條件Fig.3 Optimization of the expression conditions of PRL protein induced by IPTG in E.coli

2.6 包涵體的制備

取超聲波破碎處理的誘導菌液沉淀和上清進行Tricine-SDS-PAGE電泳系統(tǒng)進行檢測，結(jié)果表明，融合蛋白大部分以包涵體的形式存在，在45 kDa位置有一明顯符合預期大小的條帶（圖4）。

2.7 Western blot檢測重組蛋白

2.7.1 對純化的PRL基因融合蛋白用凝血酶進行酶切，可得到純化后的45 kDa的TrxA-PRL片段融合蛋白和26 kDa的PRL片段單體蛋白。用核酸基因定量儀測得純化的融合蛋白和酶切后單體蛋白濃度分別為1.07 mg·mL-1和 0.55 mg·mL-1，凝膠掃描顯示經(jīng)凝血酶酶切后單體蛋白占總蛋白的51.4%左右（圖5）。

圖4 包涵體蛋白Fig.4 The inclusion bodies

圖5 融合蛋白的純化及酶切產(chǎn)物圖譜Fig.5 Purification of fusion protein and Identification of pET-32a（+）-PRL detected by thrombin digested

2.7.2 本試驗以純化的原核融合表達產(chǎn)物和純化的凝血酶酶切產(chǎn)物為抗原，用Western blot法對所制備抗體的特異性進行了檢測。檢測結(jié)果表明，所制抗體可很清晰地檢測到PRL基因表達蛋白的特異帶，表明特異性較好（圖6）。

圖6 融合蛋白與單體蛋白的Western blot鑒定Fig.6 Identification of fusion protein and monomer protein detected by Western blot

3 討論

3.1 同源性分析

目前已得出了20多種脊椎動物PRL的一級結(jié)構(gòu)，其成熟蛋白共由190～200個氨基酸組成，相對分子量22～25 kDa[1]。其分子量存在物種差異，據(jù)測綿羊PRL的分子量為22.5 kDa，豬的為25 kDa。家禽又存在品種差異，已報道的禽類PRL分子量為23 kDa，其前體含有229個AA殘基，其中包含30個AA的信號肽序列和199個AA的PRL成熟蛋白。已經(jīng)測出家雞[2]、皖西白鵝[3]的PRL基因的核苷酸序列。陳興勇等通過克隆皖西白鵝和萊茵鵝PRL基因完整的編碼區(qū)序列，比較分析表明，皖西白鵝PRL堿基編碼區(qū)序列與萊茵鵝的同源性為99%，與家雞和野鴨同源性分別為94%和88%[3]。

本實驗通過對所克隆基因片段進行序列測定，同源性比對結(jié)果顯示，籽鵝在PRL編碼區(qū)序列和氨基酸序列上與皖西白鵝的同源性分別為99%（688/691）和 99%（228/229），與東北白鵝、番鴨、火雞、萊茵鵝的堿基同源性分別為100%、98%（679/690）、92%（643/694）、99%（687/691），氨基酸序列 同 源 性 分 別 為 100% 、99%（227/229）、92%（212/229）、99%（227/229），與其他人的研究結(jié)果基本一致。由于堿基的變異導致氨基酸殘基的差異，對PRL蛋白的親水性、等電點和極性等化學性質(zhì)的影響還有待于進一步研究。根據(jù)這些差異，可以推斷籽鵝與皖西白鵝在就巢性和產(chǎn)蛋性上存在的差異可能是由于催乳素基因序列的差異引起。

3.2 表達條件的優(yōu)化

本實驗還從誘導表達時間、誘導溫度和IPTG工作濃度3方面對表達條件進行了優(yōu)化處理。IPTG本身具有一定的毒性，且價格昂貴，因此在一定濃度范圍內(nèi)確定它的最佳工作濃度對于目標蛋白的表達和生產(chǎn)均是必要的。本實驗分別使用終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmoL·L-1的 IPTG 對表達菌進行了誘導表達，結(jié)果終濃度為1 mmoL·L-1時表達量最大，確定為最佳工作濃度。誘導時間在4 h以后未見蛋白表達量有所增加，故確定了重組菌在誘導4 h時表達量最高。在對表達溫度的優(yōu)化上，降低誘導溫度至27℃并沒有發(fā)現(xiàn)增加蛋白的表達量，因而認為37℃為最佳誘導溫度。實際上，以上3種表達條件的優(yōu)化是同時進行的，綜合它們的表達情況，最終確定最佳的誘導表達條件為:IPTG終濃度1 mmoL·L-1，37℃下誘導時間5 h。

3.3 Western blot檢測

利用優(yōu)化的誘導表達條件制備出融合蛋白，對其檢測后結(jié)果表明，融合蛋白大部分以包涵體的形式存在，大小約為45 kDa。Western blot檢測結(jié)果表明，所制抗體有較好的免疫特異性。

禽類的PRL則主要調(diào)節(jié)母禽的就巢和孵卵等母性行為，火雞和鴿剛?cè)敕酰ň统玻r，PRL顯著升高，以維持其正常的孵化期[4]。Sharp PJ[5]通過對矮腳雞的研究發(fā)現(xiàn)，在就巢開始前血漿中PRL含量隨著母禽進入產(chǎn)蛋窩次數(shù)的增加而提高，最終達到一最大值；當進巢行為逐漸固定時，夜間PRL最大值可保持到第2天。促進就巢的神經(jīng)機制對一些環(huán)境條件的敏感性很強，通過促進分泌PRL，加強就巢行為；一旦形成固定的就巢行為，又可促進內(nèi)源性PRL的分泌，并由內(nèi)源性PRL來維持就巢行為[6]，如果把就巢火雞的產(chǎn)蛋箱移走，便可終止就巢，PRL的分泌量減少；若在2～3 d內(nèi)重新給予產(chǎn)蛋箱，仍可使火雞恢復就巢，并使PRL分泌量又升高。對移走蛋箱的就巢期環(huán)鴿和矮腳雞注射羊PRL，可以繼續(xù)維持就巢。施振旦等發(fā)現(xiàn)，在就巢時將蛋換成乒乓球，甚至將蛋取走，惠陽三黃胡須雞就巢仍能持續(xù)50 d以上，直到將蛋箱取走就巢才停止。周敏等對家雞PRL基因結(jié)構(gòu)的研究還表明，就巢還可能是由于PRL前體的氨基酸序列中信號肽裂解位點不同[2]。Wong等的研究也表明，禽類PRL具有分泌嗉囊乳、調(diào)節(jié)代謝和維持就巢等功能[6]。Sharp PJ等[7]對火雞及鴨的研究表明，PRL與就巢有關，就巢期間PRL水平上升，就巢終止時PRL水平下降。陳杰等（1991）[8]對四季鵝繁殖性能進行研究時也得到了與Sharp等相似的結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)在使用PRL拮抗劑后，隨著PRL水平的迅速下降，就巢終止，就巢期大大縮短，可見四季鵝的就巢行為也與血漿中PRL含量的變化有關。從這些結(jié)果可以看出，就巢的發(fā)生和維持主要是受PRL調(diào)控的。該研究還發(fā)現(xiàn)，四季鵝就巢期血漿中PRL含量也存在明顯的季節(jié)性差異，春季比秋季高?？梢姡鹎蓊惥统驳年P鍵因子是PRL含量。主動免疫PRL或其釋放激素VIP（血管活性腸多肽）都可以抑制火雞、泰和雞、矮腳雞和家雞的就巢并通過增加或延長產(chǎn)蛋時間來提高產(chǎn)蛋性能（陳峰等，1997）[9]。

利用降低內(nèi)源性催乳素的水平，抑制家禽的就巢性的研究在國內(nèi)已有報道。主動免疫PRL可以抑制火雞、泰和雞、矮腳雞和家雞的就巢并通過增加或延長產(chǎn)蛋時間來提高產(chǎn)蛋性能[10]。推測將該研究的誘導蛋白作為免疫原免疫籽鵝，可以降低其就巢性，提高產(chǎn)蛋性能。

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