勞海紅 賀憲民

1.海南省婦幼保健院(?？?，570206);2.海南主健細(xì)胞分子遺傳醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心

5，10－亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)是葉酸代謝通路中的關(guān)鍵酶。MTHFR C677T與神經(jīng)管缺陷(NTDs)的關(guān)聯(lián)關(guān)系研究在國內(nèi)和國外開展很普遍，TT基因型是NTDs發(fā)生的遺傳危險因素;MTHFR A1298C、MTRR A66G也都在國內(nèi)和國外的人群中被研究證明與NTDs的發(fā)生相關(guān)。神經(jīng)管缺陷是一類發(fā)生率高、后果嚴(yán)重的出生缺陷，是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，為多基因遺傳疾?。?］。本研究的目的在于比較海南省漢族和黎族婦女人群MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G多態(tài)性分布情況，獲得群體遺傳學(xué)特征，了解葉酸代謝相關(guān)基因在不同人群的分布，為不同人群預(yù)防出生缺陷制定針對性的干預(yù)措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

依據(jù)知情同意，選擇在海南省各保健院進(jìn)行孕前或孕期檢查的女性作為研究對象，其中，漢族10 533人，黎族904人。

1.2 儀器及試劑

Centrifuge離心機(jī)(德國艾本德公司);7900HT實(shí)時熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);3730測序儀、9700 PCR擴(kuò)增儀、熒光定量緩沖液、熒光定量檢測探針、BigDye? Terminator v3.1測序試劑盒、測序緩沖液(ABI公司)和POP－7TM3730/3730xl DNA測序膠(美國生命技術(shù)公司)。檢測中對3個位點(diǎn)分別進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)所用Taqman－MGB探針信息見表1。

表1 Taqman－MGB探針?biāo)谖恢?/p>

1.3 研究方法

1.3.1 樣本DNA采集 采集受檢者的口腔黏膜上皮細(xì)胞，利用柱式抽提試劑盒抽提樣本DNA。

1.3.2 基因檢測 MTHFR 基因 C677T、A1298C和MTRR基因A66G位點(diǎn)的SNP分型采用Taqman－MGB技術(shù)。

1.3.3 熒光定量PCR反應(yīng)條件 每個反應(yīng)體系為總體積 10μl，包含濃度為 20ng/μl的 DNA 模板1μl，2 × Taqman Universal MasterMix 5μl，20 × Taqman－MGB 探針0.5μl，去離子水3.5μl。反應(yīng)條件為95℃ 10min，隨后進(jìn)行20個循環(huán)的擴(kuò)增(92℃15s，60℃ 1min)，再進(jìn)行30個循環(huán)的擴(kuò)增(89℃15s，60℃ 90s)。反應(yīng)結(jié)束后在ABI 7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品孔中的終點(diǎn)熒光，利用分析軟件確定各個樣本的基因分型結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

對獲得的數(shù)據(jù)用Excel匯總分析，不同人群間基因型及等位基因頻率用χ2檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基因型頻數(shù)分布比較(表2)

表2 兩民族婦女MTHFR、MTRR基因型頻數(shù)和頻率分布［例(%)］

2.2 研究對象的等位基因頻率比較

漢族婦女MTHFR C677T突變等位基因T 頻率高于黎族婦女，而黎族婦女MTHFR A1298C突變等位基因C、MTRR A66G突變等位基因G則高于漢族婦女(P ＜0.01)。見表3。

表3 兩民族婦女MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G等位基因頻率和頻率分布［例(%)］

3 討論

一些研究報道，不同種族人群MTHFR基因熱敏性多態(tài)性基因型分布存在差異，如國內(nèi)裴麗君等［2］報道的中國漢蒙兩族存在民族差異，但未見有關(guān)黎族的研究報道。賀憲民等［3］報道:MTHFR C677T位點(diǎn)純合突變基因型TT的頻率北方顯著高于南方(P＜0.01);南方的四川省和海南省間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02)。MTHFR A1298C基因北方純合突變基因型CC的頻率顯著低于南方(P＜0.01)，南方的四川省和海南省間無差異。MTRR A66G基因型的構(gòu)成在北方和南方間無統(tǒng)計學(xué)差異;純合突變基因型GG的構(gòu)成在北方和南方間無統(tǒng)計學(xué)差異。

本研究比較了海南省漢族和黎族婦女的MTHFR C677T位點(diǎn)純合突變基因 TT、MTHFR A1298C純合突變基因CC和MTRR A66G純合突變基因GG的頻率后發(fā)現(xiàn)，海南漢族婦女MTHFR C677T純合突變基因TT頻率明顯高于海南黎族婦女，而海南黎族婦女MTHFR A1298C純合突變基因CC和MTRR A66G純合突變基因型GG頻率顯著高于海南漢族婦女。海南漢族婦女MTHFR C677T突變等位基因T頻率顯著高于海南黎族婦女，而海南黎族婦女MTHFR A1298C突變等位基因C、MTRR A66G突變等位基因G則顯著高于海南漢族婦女。

目前認(rèn)為，MTHFR和MTRR是葉酸代謝過程的關(guān)鍵酶，如果這些酶活性或濃度下降均可使同型半胱氨酸的甲基化發(fā)生障礙，導(dǎo)致同型半胱氨酸水平升高，是心血管系統(tǒng)疾病和子代發(fā)生NTDs的重要危險因素。國外研究表明，攜帶MTHFR突變基因型的個體發(fā)生冠心病的危險性增加，父母攜帶突變基因型增加子代 NTDs發(fā)生的危險性［4，5］。國內(nèi)李智文等［6］報道，攜帶MTHFR突變基因型的個體發(fā)生冠心病以及子代發(fā)生NTDs的危險性顯著上升;特別是攜帶純合突變基因型的個體，其冠心病發(fā)生的危險性是野生型的2.35倍;父母攜帶純合突變基因型，子代NTDs的危險性增加3.13倍。

本研究顯示，海南省漢族和黎族婦女MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布存在顯著差異。這種差異要求在制定相關(guān)人群健康干預(yù)方案時不能使用統(tǒng)一模式、執(zhí)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，而應(yīng)是因人而異，制定有針對性的干預(yù)措施。

1 朱軍，王和.增補(bǔ)小劑量葉酸預(yù)防神經(jīng)管缺陷［M］.成都:成都時代出版社，2008:1－4.

2 裴麗君，朱慧萍，沈婉英，等.中國漢蒙兩族人群MTHFR基因熱敏感性多態(tài)性分布的比較［J］.遺傳，2000，22(6):371.

3 賀憲民，張群，楊琦，等.亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態(tài)性研究［J］.中國計劃生育學(xué)雜志，2010，18(1):15－16.

4 Pan XR，Li GW，Hu YH，et al.Effects of diet and exercise in preventing NIDDM in people with impaired glucose tolerance:the Da Qing IGT and Diabetes Study ［J］.Diabetes Care，1997，20(4):537－544.

5 UK Prospective Diabetes Study Group.Effect of intensive bloodglucose control with metformin on complications in overweight patients with type 2 diabetes［J］.Lancet，1998，352(9139):854－856.

6 李智文，張暉，王麗娜.中國人5，10亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與冠心病、神經(jīng)管畸形易感性關(guān)系的Meta分析［J］.中國慢性病預(yù)防與控制，2004，12(4):165.