勞海紅 賀憲民
1.海南省婦幼保健院(海口,570206);2.海南主健細(xì)胞分子遺傳醫(yī)學(xué)檢驗中心
5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)是葉酸代謝通路中的關(guān)鍵酶。MTHFR C677T與神經(jīng)管缺陷(NTDs)的關(guān)聯(lián)關(guān)系研究在國內(nèi)和國外開展很普遍,TT基因型是NTDs發(fā)生的遺傳危險因素;MTHFR A1298C、MTRR A66G也都在國內(nèi)和國外的人群中被研究證明與NTDs的發(fā)生相關(guān)。神經(jīng)管缺陷是一類發(fā)生率高、后果嚴(yán)重的出生缺陷,是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,為多基因遺傳疾?。?]。本研究的目的在于比較海南省漢族和黎族婦女人群MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G多態(tài)性分布情況,獲得群體遺傳學(xué)特征,了解葉酸代謝相關(guān)基因在不同人群的分布,為不同人群預(yù)防出生缺陷制定針對性的干預(yù)措施提供科學(xué)依據(jù)。
依據(jù)知情同意,選擇在海南省各保健院進(jìn)行孕前或孕期檢查的女性作為研究對象,其中,漢族10 533人,黎族904人。
Centrifuge離心機(jī)(德國艾本德公司);7900HT實時熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);3730測序儀、9700 PCR擴(kuò)增儀、熒光定量緩沖液、熒光定量檢測探針、BigDye? Terminator v3.1測序試劑盒、測序緩沖液(ABI公司)和POP-7TM3730/3730xl DNA測序膠(美國生命技術(shù)公司)。檢測中對3個位點分別進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)所用Taqman-MGB探針信息見表1。
表1 Taqman-MGB探針?biāo)谖恢?/p>
1.3.1 樣本DNA采集 采集受檢者的口腔黏膜上皮細(xì)胞,利用柱式抽提試劑盒抽提樣本DNA。
1.3.2 基因檢測 MTHFR 基因 C677T、A1298C和MTRR基因A66G位點的SNP分型采用Taqman-MGB技術(shù)。
1.3.3 熒光定量PCR反應(yīng)條件 每個反應(yīng)體系為總體積 10μl,包含濃度為 20ng/μl的 DNA 模板1μl,2 × Taqman Universal MasterMix 5μl,20 × Taqman-MGB 探針0.5μl,去離子水3.5μl。反應(yīng)條件為95℃ 10min,隨后進(jìn)行20個循環(huán)的擴(kuò)增(92℃15s,60℃ 1min),再進(jìn)行30個循環(huán)的擴(kuò)增(89℃15s,60℃ 90s)。反應(yīng)結(jié)束后在ABI 7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品孔中的終點熒光,利用分析軟件確定各個樣本的基因分型結(jié)果。
對獲得的數(shù)據(jù)用Excel匯總分析,不同人群間基因型及等位基因頻率用χ2檢驗分析。
表2 兩民族婦女MTHFR、MTRR基因型頻數(shù)和頻率分布[例(%)]
漢族婦女MTHFR C677T突變等位基因T 頻率高于黎族婦女,而黎族婦女MTHFR A1298C突變等位基因C、MTRR A66G突變等位基因G則高于漢族婦女(P <0.01)。見表3。
表3 兩民族婦女MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G等位基因頻率和頻率分布[例(%)]
一些研究報道,不同種族人群MTHFR基因熱敏性多態(tài)性基因型分布存在差異,如國內(nèi)裴麗君等[2]報道的中國漢蒙兩族存在民族差異,但未見有關(guān)黎族的研究報道。賀憲民等[3]報道:MTHFR C677T位點純合突變基因型TT的頻率北方顯著高于南方(P<0.01);南方的四川省和海南省間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02)。MTHFR A1298C基因北方純合突變基因型CC的頻率顯著低于南方(P<0.01),南方的四川省和海南省間無差異。MTRR A66G基因型的構(gòu)成在北方和南方間無統(tǒng)計學(xué)差異;純合突變基因型GG的構(gòu)成在北方和南方間無統(tǒng)計學(xué)差異。
本研究比較了海南省漢族和黎族婦女的MTHFR C677T位點純合突變基因 TT、MTHFR A1298C純合突變基因CC和MTRR A66G純合突變基因GG的頻率后發(fā)現(xiàn),海南漢族婦女MTHFR C677T純合突變基因TT頻率明顯高于海南黎族婦女,而海南黎族婦女MTHFR A1298C純合突變基因CC和MTRR A66G純合突變基因型GG頻率顯著高于海南漢族婦女。海南漢族婦女MTHFR C677T突變等位基因T頻率顯著高于海南黎族婦女,而海南黎族婦女MTHFR A1298C突變等位基因C、MTRR A66G突變等位基因G則顯著高于海南漢族婦女。
目前認(rèn)為,MTHFR和MTRR是葉酸代謝過程的關(guān)鍵酶,如果這些酶活性或濃度下降均可使同型半胱氨酸的甲基化發(fā)生障礙,導(dǎo)致同型半胱氨酸水平升高,是心血管系統(tǒng)疾病和子代發(fā)生NTDs的重要危險因素。國外研究表明,攜帶MTHFR突變基因型的個體發(fā)生冠心病的危險性增加,父母攜帶突變基因型增加子代 NTDs發(fā)生的危險性[4,5]。國內(nèi)李智文等[6]報道,攜帶MTHFR突變基因型的個體發(fā)生冠心病以及子代發(fā)生NTDs的危險性顯著上升;特別是攜帶純合突變基因型的個體,其冠心病發(fā)生的危險性是野生型的2.35倍;父母攜帶純合突變基因型,子代NTDs的危險性增加3.13倍。
本研究顯示,海南省漢族和黎族婦女MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布存在顯著差異。這種差異要求在制定相關(guān)人群健康干預(yù)方案時不能使用統(tǒng)一模式、執(zhí)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),而應(yīng)是因人而異,制定有針對性的干預(yù)措施。
1 朱軍,王和.增補(bǔ)小劑量葉酸預(yù)防神經(jīng)管缺陷[M].成都:成都時代出版社,2008:1-4.
2 裴麗君,朱慧萍,沈婉英,等.中國漢蒙兩族人群MTHFR基因熱敏感性多態(tài)性分布的比較[J].遺傳,2000,22(6):371.
3 賀憲民,張群,楊琦,等.亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態(tài)性研究[J].中國計劃生育學(xué)雜志,2010,18(1):15-16.
4 Pan XR,Li GW,Hu YH,et al.Effects of diet and exercise in preventing NIDDM in people with impaired glucose tolerance:the Da Qing IGT and Diabetes Study [J].Diabetes Care,1997,20(4):537-544.
5 UK Prospective Diabetes Study Group.Effect of intensive bloodglucose control with metformin on complications in overweight patients with type 2 diabetes[J].Lancet,1998,352(9139):854-856.
6 李智文,張暉,王麗娜.中國人5,10亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與冠心病、神經(jīng)管畸形易感性關(guān)系的Meta分析[J].中國慢性病預(yù)防與控制,2004,12(4):165.