李雪春楊曉寧李善茂

（1防化指揮工程學(xué)院，北京市昌平區(qū)陽坊，102205；2中國醫(yī)藥研究開發(fā)中心有限公司；3亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）

大孔吸附樹脂分離純化胡黃連中胡黃連苷Ⅱ的工藝研究

李雪春1，2楊曉寧3李善茂1

（1防化指揮工程學(xué)院，北京市昌平區(qū)陽坊，102205；2中國醫(yī)藥研究開發(fā)中心有限公司；3亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）

胡黃連；大孔吸附樹脂分離純化

胡黃連為玄參科植物胡黃連（Picrorhiza scrophulariiflora Pennell）的干燥根莖，是一味傳統(tǒng)中藥，具有清熱涼血、燥濕消疳的作用，用于小兒驚癇、疳積、瀉痢、骨蒸勞熱、自汗、盜汗、吐血、目疾、痔瘺、瘡腫等。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，胡黃連中環(huán)烯醚萜苷類成分具有抗乙型肝炎病毒及保肝、降酶等多種藥理活性［1］。本實驗旨在優(yōu)選出一種適合分離胡黃連苷Ⅱ的大孔樹脂，并對優(yōu)選出的大孔樹脂分離胡黃連苷Ⅱ的工藝條件及參數(shù)進(jìn)行研究，篩選出工藝簡單、方法可靠的分離純化工藝。

1 儀器與試劑

HP1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄖ袊幤飞镏破窓z定所，批號：111596-200301）；胡黃連藥材（云南藥材公司）；D101、D201、AB-8和NKA-9大孔吸附樹脂（南開大學(xué)化工廠）；DB301大孔吸附樹脂（天津歐瑞生物科技有限公司）

2 方法與結(jié)果

2.2 胡黃連提取液的制備 稱取胡黃連藥材粗粉1000g，每次加入70%乙醇8L熱回流提取1h，提取3次。提取液濾過、合并，減壓回收乙醇后，按需要加水稀釋至一定體積。

2.3 大孔樹脂的預(yù)處理 將大孔樹脂用95%的乙醇浸泡12h，濕法裝柱，用95%的乙醇液洗脫2倍柱體積（BV），然后用水洗凈乙醇，加2%的鹽酸溶液浸泡、洗脫，水洗至pH值中性，加2%氫氧化鈉溶液浸泡、洗脫，水洗至pH值中性，最后用95%的乙醇液洗至流出液加等量水無白色渾濁現(xiàn)象，再用水洗凈乙醇備用。

2.4 樹脂型號的篩選 取凈化好的型號為NKA-9、AB-8、D201、DB301、D101型大孔吸附樹脂各10g，濕法裝柱。吸取相同已知胡黃連苷Ⅱ濃度的提取液各50mL，以相同流速通過樹脂柱，并分別用20mL（約合1個柱體積）的水洗脫，合并相應(yīng)的流出藥液和水洗液，混勻，定容，備用。再分別用70%的乙醇各150mL洗脫，收集洗脫液，定容，備用。分別測定胡黃連提取液、各樹脂柱流出液-水洗液樣品和70%乙醇洗脫液樣品中胡黃連苷Ⅱ的量，計算不同型號樹脂的吸附容量和洗脫率，結(jié)果見表1。

表1 樹脂型號篩選結(jié)果（n=2）

由以上結(jié)果可以看出，以D101大孔樹脂的吸附容量最大，為其他樹脂型號的1.4～2.8倍，且70%乙醇洗脫率可以達(dá)到97%，洗脫效果較好，故選用D101大孔樹脂。

2.5 洗脫劑的考察 取凈化好的D101大孔樹脂約100g，裝柱，通過相同已知胡黃連苷Ⅱ濃度的胡黃連提取液100mL，并水洗至無色，收集水洗液，混勻，備用。繼續(xù)分別用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇分別洗至無色，收集各乙醇濃度的洗脫液，混勻，備用。分別測定以上洗脫液中胡黃連苷Ⅱ的含量和固形物量，結(jié)果見表2。

表2 洗脫劑篩選結(jié)果（n=2）

由以上結(jié)果可以看出，胡黃連苷Ⅱ主要集中在30%乙醇的洗脫液中，占總洗脫量的87.3%，胡黃連苷Ⅱ的純度為52.2%。若采用40%的乙醇洗脫，洗脫率雖然高，但胡黃連苷Ⅱ純度下降到43.2%，直接影響到后續(xù)純化結(jié)晶的收率。因此，選用30%的乙醇為洗脫劑，并采取先水洗，20%的乙醇洗，然后30%乙醇洗脫，收集30%洗脫液。

2.6 上柱藥液濃度考察 取凈化好的等量D101大孔樹脂裝柱，分別以相同流速通過稀釋的不同濃度的胡黃連提取液。提取液中藥材（g）與體積（mL）比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（藥材/g∶體積/mL）。上樣后分別用20mL的水洗脫，合并相應(yīng)的流出藥液和水洗液，測定其中胡黃連苷Ⅱ的含量，計算樹脂的吸附容量，結(jié)果見表3。

表3 上柱藥液濃度對吸附性能的影響（n=2）

以上結(jié)果可以看出，藥液濃度對樹脂吸附容量的影響不是很大，從數(shù)據(jù)直觀分析，選用藥液比例濃度為1∶2的藥液，即選用藥材濃度為0.5g·mL-1的藥液上樣。

[1]杜維明：《儒家傳統(tǒng)與文明對話》，彭國翔編譯，石家莊：河北人民出版社，2006年，第4、226頁。

2.7 吸附流速的考察 取凈化好的等量D101大孔樹脂分別裝柱備用。取相同已知胡黃連苷Ⅱ濃度的藥液（藥材與體積比為1∶2）分別以BV·h-1、2BV· h-1、3BV·h-1、4BV·h-1、5BV·h-1的流速通過樹脂，并分別用20mL的水洗脫，合并相應(yīng)的流出藥液和水洗液，測定其中胡黃連苷Ⅱ的含量，計算樹脂的吸附容量，結(jié)果見表4。

表4 吸附流速考察結(jié)果（n=2）

以上結(jié)果可以看出，上柱藥液流速對樹脂吸附影響較為明顯，從數(shù)據(jù)結(jié)果來看，上柱的最佳流速為3BV ·h-1。

2.8 柱徑比的考察 取不同直徑的樹脂柱，分別裝入凈化好的D101大孔樹脂，樹脂柱的柱徑比分別為3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1，以相同流速通過相同已知胡黃連苷Ⅱ濃度的藥液（藥材與體積比為1∶2），并以4倍樹脂體積的水洗至洗脫液無色，合并相應(yīng)的流出液和水洗液，測定其中胡黃連苷Ⅱ的量，計算樹脂的吸附容量，結(jié)果見表5。

表5 柱徑比考察結(jié)果（n=2）

由以上結(jié)果可以看出，柱徑比例越大，樹脂相應(yīng)的吸附容量越高，從上述數(shù)據(jù)結(jié)果結(jié)合生產(chǎn)實際考慮，柱徑比例為7∶1時較為合適。

表6 藥材與樹脂比例考察結(jié)果（n=2）

2.9 藥材與樹脂比例考察 取凈化好的等量的D101大孔樹脂分別裝柱，以相同流速分別通過相同已知胡黃連苷Ⅱ濃度的藥液（藥材與體積比為1∶2），通過樹脂柱藥液含胡黃連藥材和樹脂的比例分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8，繼續(xù)用同體積的水洗至流出液無色，合并相應(yīng)的流出液和水洗液，測定其中胡黃連苷Ⅱ的量，結(jié)果見表6。

由以上結(jié)果可以看出，當(dāng)藥材和樹脂比例達(dá)到1∶4時，胡黃連苷Ⅱ的泄漏量不足1.5%。當(dāng)藥材和樹脂比例達(dá)到1∶6時，在上柱流出液和水洗液中檢不出胡黃連苷Ⅱ?？紤]到實際操作過程和試驗之間存在的差異和樹脂柱的反復(fù)使用，為安全起見，藥材和樹脂的比例選用1∶6。

2.10 洗脫流速 屠鵬飛等［2］建議洗脫流速采用全流速。而且在用30%乙醇洗脫時，全流速不足水洗脫全流速的20%，因此洗脫流速不作考察，采用全流速。

2.11 收集洗脫液量的考察 取已知吸附胡黃連苷Ⅱ量的大孔樹脂柱（經(jīng)20%乙醇洗脫后，樹脂體積約為60mL），用30%乙醇洗脫，每洗脫120mL收集1個樣品，測定樣品中胡黃連苷Ⅱ的含量，計算洗脫率，結(jié)果顯示，當(dāng)洗脫液收集到樹脂體積的6倍量時，洗脫率已經(jīng)可以達(dá)到94%，繼續(xù)洗脫收效甚微，浪費工時，因此收集洗脫液的量為樹脂的6倍體積即可。

2.12 放大試驗 取凈品級的D101大孔樹脂18Kg，裝柱（Ф=18cm），柱徑比為7∶1，用乙醇洗脫至洗液與水1∶4混合，不產(chǎn)生渾濁，繼續(xù)用水洗至洗液不含醇，備用。

取3Kg胡黃連藥材的提取液6L（胡黃連苷Ⅱ的濃度為46.7mg/mL）。將藥液以3BV·h-1的流速通過大孔樹脂柱，并分別以水和20%乙醇洗脫至洗脫液近無色，分別收集，備用。以30%乙醇洗脫，收集30%乙醇洗脫液200L（約計6倍樹脂體積），減壓濃縮至小體積備用。

分別測定水洗液、20%乙醇洗脫液和30%乙醇洗脫液中胡黃連苷Ⅱ的量，計算洗脫率。取30%乙醇洗脫濃縮液適量，測定固形物，計算胡黃連苷Ⅱ純度。結(jié)果見表7。

表7 放大試驗結(jié)果

由以上結(jié)果可以看出，總洗脫率達(dá)到91.8%，其中30%乙醇洗脫液中胡黃連苷Ⅱ的量占上樣總量的85.5%，因在藥液的濃縮過程中胡黃連苷Ⅱ也會有小部分的損失，因此認(rèn)為洗脫過程較為完全，此樹脂分離純化工藝可行。

3 討論

本試驗以吸附容量和洗脫為指標(biāo)，采用動態(tài)吸附法對大孔吸附樹脂分離純化胡黃連苷Ⅱ的工藝進(jìn)行了系統(tǒng)地篩選考察，最終確定的工藝為：取凈化好的D101大孔吸附樹脂裝柱，柱徑比為7∶1，上柱藥液濃度為1∶2（藥材/g∶體積/mL），上樣量與樹脂的比例為1∶6（藥材量/g∶樹脂量/g），以3BV·h-1的流速通過大孔樹脂柱，分別用水、20%的乙醇洗脫至流出液近無色，再用30%乙醇洗脫，收集6倍樹脂體積的30%乙醇洗脫液即可。

［1］黃林清，張恩娟，王軍，等.胡黃連的研究進(jìn)展.《中國藥業(yè)》，2007，16（7）：1-2.

［2］屠鵬飛，賈存琴，張洪全，等.大孔吸附樹脂在中藥新藥研究和生產(chǎn)中的應(yīng)用.《世界科學(xué)技術(shù)》，2004，6（3）：22-28.

（2011 -01 -21 收稿）