李彩霞,王慧玲,胡旭初,余新炳

2.廣東省人民醫(yī)院肝膽外科,廣州 510080

3.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)教研室,廣州 510080

華支睪吸蟲(chóng)(Clonorchis sinensis)又稱(chēng)肝吸蟲(chóng)(liver fluke),其寄生在人體肝膽管內(nèi)所引起的以肝膽病變?yōu)橹鞯募膊》Q(chēng)為華支睪吸蟲(chóng)病(clonorchiasis),又稱(chēng)肝吸蟲(chóng)病,是我國(guó)主要的食源性寄生蟲(chóng)病之一[1]。2005年,華支睪吸蟲(chóng)病被廣東省政府列為重點(diǎn)防治的地方病。2006年,華支睪吸蟲(chóng)病被衛(wèi)生部列為我國(guó)重點(diǎn)防治的寄生蟲(chóng)病之一,因此,加強(qiáng)對(duì)華支睪吸蟲(chóng)病的診斷和防治工作是目前的當(dāng)務(wù)之急。

目前華支睪吸蟲(chóng)病的診斷主要依靠病原學(xué)檢查和免疫學(xué)檢查。傳統(tǒng)的病原學(xué)方法是鏡檢糞便中的蟲(chóng)卵,由于華支睪吸蟲(chóng)排卵具有周期性且蟲(chóng)卵很小,容易漏診,且操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力,不適合流行病學(xué)調(diào)查;免疫學(xué)診斷的抗原主要是成蟲(chóng)粗抗原,但粗抗原制備困難,來(lái)源有限,且交叉反應(yīng)較嚴(yán)重。尋找高敏感性和高特異性的抗原成分,是解決華支睪吸蟲(chóng)病早期快速準(zhǔn)確診斷的關(guān)鍵。

有研究發(fā)現(xiàn)華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2(C.sinensis cy tosolic 28-kDaG lutathione transferases,Cs GST2)對(duì)華支睪吸蟲(chóng)病具有重要診斷價(jià)值[2],但其敏感性不甚理想。華支睪吸蟲(chóng)表膜相關(guān)蛋白能引起顯著的免疫保護(hù),有良好的免疫原性,被視為潛在的診斷抗原[3]。本研究將華支睪吸蟲(chóng)GST2和表膜相關(guān)蛋白編碼基因TP22.3先后克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+),構(gòu)建融合蛋白,獲得了高效表達(dá)并已純化,初步證明具有良好的免疫原性,為進(jìn)一步研究其免疫反應(yīng)性以及作為診斷抗原價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 文庫(kù),質(zhì)粒,菌株 華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的新鮮貓肝獲得,華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)由本室構(gòu)建,其克隆載體為pBluescriptⅡSK的改造載體(即Eco RⅠ和NotⅠ之間的序列改造為S f iⅠA和S f iⅠB接頭序列)由上海聯(lián)眾科技研究院完成,大腸桿菌DH 5α、BL21及原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)為本室常規(guī)保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠(5～7 w),由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.3 主要試劑和工具酶 Ex Taq酶(含dN TP),Eco R Ⅰ,SaLⅠ,K pnⅠ,Bam HⅠ和T4 DNA連接酶,DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL15 000,DL2 000)均購(gòu)自TAKARA公司;異丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG),購(gòu)自美國(guó)Promega公司;Ni-IDA Agarose(cat No:69670)購(gòu)自美國(guó)Novagen公司;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自立陶宛MBI公司;DNA凝膠回收試劑盒,質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自北京賽百盛基因公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG、DAB(3,3二氨基聯(lián)苯胺)顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;PVDF膜購(gòu)自Millipore公司;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;TMB顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 基因識(shí)別和引物合成 將獲得的華支睪成蟲(chóng)unigene進(jìn)行Blastx分析,從中選取華支睪吸蟲(chóng)GST2基因以及一個(gè)表膜相關(guān)蛋白基因(質(zhì)粒編號(hào)為18D11),后者根據(jù)其分子量大小暫命名為華支睪吸蟲(chóng)22.3kDa表膜相關(guān)蛋白(Cs TP22.3)。利用DNA club和 PCRdesign軟件,根據(jù) Cs GST2、Cs TP22.3及pET32a(+)特異性酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)4條引物:Cs GST2上游引物 P1引入保護(hù)性堿基GCA和K pnⅠ酶切位點(diǎn),下游引物P2刪除中止密碼子TGA,引入保護(hù)性堿基ATA和Bam HⅠ酶切位點(diǎn);Cs TP22.3上游引物P3引入保護(hù)性堿基CGGC和EcoR I酶切位點(diǎn),下游引物P4加入保護(hù)性堿基AAAC和SaLⅠ酶切位點(diǎn)。

P1:5′-GCAGGTACCATGAAACACAGACA -3′;P2:5′- ATAGGATCCCAGGACGGTCTCT-3′;P3:5′-CGGCGAATTCATGTGCGCGCTT-3′;P4:5′-AAACGTCGACTCATACCCACGGT-3′。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 基因PCR擴(kuò)增及鑒定 分別以P1、P2和P3、P4為引物,PCR擴(kuò)增Cs GST2和Cs TP22.3基因片段。Cs GST2反應(yīng)條件:預(yù)變性,95℃,3min;變性,94℃,1min;退火,57℃,50s;延伸 72℃,1min;30個(gè)循環(huán)。最后再72℃延伸8min。Cs TP22.3反應(yīng)條件:預(yù)變性,94℃,5min;變性,94℃,30s;退火,56℃,30 s;延伸,72℃,90 s;35個(gè)循環(huán)。最后再72℃延伸8min。分別取PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3構(gòu)建及鑒定 將Cs GST2基因擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET32a(+)經(jīng)K pnⅠ和Bam HⅠ雙酶切后回收,連接,構(gòu)建重組pET32a(+)-CS GST2質(zhì)粒,經(jīng)鑒定后,將Cs TP22.3基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別以Eco RI和SaLⅠ雙酶切,與同樣經(jīng)雙酶切的pET32a(+)-Cs GST2連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21/DE3,經(jīng)鑒定重組成功后,將此菌接種于5m L LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素)37℃振搖過(guò)夜培養(yǎng),分別取2m L菌液抽提質(zhì)粒送測(cè)序鑒定及10μL重新接種入LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素)37℃振搖培養(yǎng)至 OD600=0.6,加入 IPTG至終濃度為1mm ol/L。37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h后離心收集沉淀,加入1×SDS上樣緩沖液100μL,煮沸5min。取10μL裂解上清作12%SDS-PAGE電泳。同時(shí)設(shè)pET32a(+)質(zhì)粒的誘導(dǎo)前后及重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)前做對(duì)照。

1.2.4 重組pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3融合蛋白的純化 大量培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、離心收集菌體(方法與1.2.3相同)。超聲破菌后 4°C離心13 000r/min×20min,收集包涵體沉淀。分別用0.15m ol/L的PBS、含2m ol/L尿素的PBS重懸包涵體、離心棄上清,然后將包涵體用含6mol/L尿素的PBS溶解變性后,離心收集上清,用0.45μm 濾膜過(guò)濾,參照Ni-IDA Agarose說(shuō)明書(shū),進(jìn)行蛋白純化,收集蛋白洗脫液。將蛋白洗脫液于0.15mol/L的PBS(p H 7.4)中透析24h。

1.2.5 免疫大鼠血清的預(yù)吸附 取一個(gè)經(jīng)pET-32a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21/DE3單菌落,按照1.2.3方法培養(yǎng)1 000m L含pET-32a(+)質(zhì)粒的大腸桿菌菌液,4℃、8 000r/min離心 20min,上清棄去,加入10m L PBS重懸沉淀菌體后冰上超聲破碎,4℃、13 000 r/min離心20 min,收集上清即 pET-32a(+)表達(dá)后BL21/DE3裂解液,-20℃保存?zhèn)溆?。?.2.4中pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3融合蛋白純化產(chǎn)物按照常規(guī)方法免疫SD大鼠,制備抗血清。將上述100μL大鼠血清中加入上述裂解液900μL,于4℃平緩搖振過(guò)夜。4℃、13 000 r/min離心20 min,收集上清。上清液再按1∶5比例加入以上裂解液,4℃平緩搖振過(guò)夜。4℃、13 000 r/min離心 20 min,收集上清,分裝成小份,-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 Western b lotting檢測(cè)重組蛋白的免疫原性 將純化后的融合蛋白SDS-PAGE(12%)電泳完畢后采用半干電轉(zhuǎn)移方式,將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。分別以1.2.5中處理過(guò)的免疫大鼠血清為一抗、1∶2000稀釋的羊抗大鼠IgG為二抗作用后,DAB顯色至出現(xiàn)目的條帶,去離子水終止反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 重組 pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cs GST2及重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3酶切鑒定結(jié)果正確,見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 pET-32a(+)-Cs GST2重組質(zhì)粒的PCR及雙酶切鑒定圖Fig.1 The identification of the pET-32a(+)-Cs GST2 by PCR amplification and digestion with restriction enzymes

2.2 重組 pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3融合蛋白的表達(dá)、純化 SDS-PAGE證實(shí)在IPTG誘導(dǎo)下,將表達(dá)菌體進(jìn)行超聲破碎后,經(jīng)離子交換柱進(jìn)行純化后獲得了純度較高的融合蛋白,在分子量大小約 62kDa處有一明顯蛋白表達(dá)條帶,與重組pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3融合蛋白的分子量大小一致,在其下方亦出現(xiàn)若干較弱蛋白表達(dá)條帶,分析可能為融合蛋白降解所致(見(jiàn)圖3)。

圖2 pET-32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3重組質(zhì)粒的PCR及雙酶切鑒定圖Fig.2 The identification of the pET-32a(+)-Cs GST 2-Cs TP22.3 by PCR amplification and digestion with restriction enzyme

圖3 融合蛋白pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3的表達(dá)及純化Fig.3 Expression and purification of pET-32a(+)-Cs GST 2-Cs TP22.3

2.3 Western b lotting鑒定其免疫原性 經(jīng)Western blotting鑒定發(fā)現(xiàn),免疫大鼠血清能識(shí)別相對(duì)分子量為62kDa大小的反應(yīng)條帶,與預(yù)期值相符。而含空質(zhì)粒的大腸桿菌樣品及陰性鼠血清無(wú)任何反應(yīng)帶出現(xiàn),證實(shí)了該表達(dá)蛋白具有良好的免疫原性(圖4)。

3 討 論

目前,有關(guān)華支睪吸蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、致病機(jī)制以及高效快速診斷方法的研究正在逐步進(jìn)行,這些研究的全面開(kāi)展對(duì)華支睪吸蟲(chóng)病的防治具有重要意義。傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷因華支睪吸蟲(chóng)排卵的周期性及蟲(chóng)卵比較小,容易漏診,不適合大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。華支睪吸蟲(chóng)抗原種類(lèi)多而復(fù)雜,在宿主體內(nèi)表達(dá)的數(shù)量、種類(lèi)或時(shí)機(jī)可能隨病人的個(gè)體免疫背景和病程而異,因此,使用單一抗原進(jìn)行檢測(cè)可能會(huì)導(dǎo)致敏感性低。因此對(duì)華支睪吸蟲(chóng)病的血清學(xué)檢測(cè),尚未發(fā)現(xiàn)敏感性與特異性均較滿意的檢測(cè)抗原。但隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,可依據(jù)需要對(duì)基因進(jìn)行剪切、連接等可提高診斷的敏感性和特異性[4],這也是診斷試劑研制的發(fā)展方向。

圖4 純化產(chǎn)物被該蛋白免疫的大鼠血清識(shí)別Fig.4 The recombinant protein recognized by antisera of SD rat1:Protein marker,2:the purified product of pET-32a(+)with antisera of SD rat,3:The recombinant protein recognized by normal serum of SD rat,4:The recombinant protein recognized by antiseraof SD rat

蟲(chóng)體表膜抗原因與宿主直接接觸產(chǎn)生致敏作用,誘發(fā)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答,并產(chǎn)生保護(hù)性免疫力,所以這類(lèi)抗原在寄生蟲(chóng)感染免疫中倍受重視[5-6],如日本血吸蟲(chóng)表膜相關(guān)抗原在血吸蟲(chóng)病疫苗發(fā)展和免疫診斷方面起重要作用[7]。華支睪吸蟲(chóng)表膜蛋白(TP22.3)存在于囊蚴和成蟲(chóng)等各期的表膜上,與宿主直接接觸,引起宿主較強(qiáng)免疫反應(yīng)[3],有較高的診斷價(jià)值。但進(jìn)一步研究卻發(fā)現(xiàn),表膜蛋白在溶液中不穩(wěn)定,易降解,嚴(yán)重限制了其作為診斷抗原價(jià)值。有報(bào)道指出采用融合谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽的原核表達(dá)策略,可增加重組蛋白的穩(wěn)定性[8]。GST是廣泛存在于各種生物體內(nèi)的由多個(gè)基因編碼的、具有多功能的同工酶,谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2是華支睪吸蟲(chóng)疫苗理想的候選抗原,且對(duì)華支睪吸蟲(chóng)病也具有重要診斷價(jià)值 ,但其敏感性仍不甚理想。因此,將GST2和TP22.3構(gòu)建重組融合蛋白,可望成為診斷華支睪吸蟲(chóng)感染的理想抗原。

在Cs GST2和Cs TP22.3的連接方面,本研究應(yīng)用傳統(tǒng)的基因重組技術(shù),選取特異性的限制性內(nèi)切酶,成功的將Cs TP22.3和Cs GST2兩種華支睪吸蟲(chóng)特異性抗原先后克隆至同一載體 pET-32a(+),充分保持了基因的連續(xù)性和完整性,使各個(gè)蛋白能夠較大程度地保持其原有的生物活性,既增加了Cs TP22.3的穩(wěn)定性,又可以兼具兩種重組蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)和抗原特性,在保證特異性的基礎(chǔ)上提高檢測(cè)靈敏度。

為了除去可能存在的抗大腸桿菌其它蛋白的抗體和抗pET32a(+)中his標(biāo)簽蛋白的抗體,盡可能消除使用大鼠血清進(jìn)行免疫原性檢測(cè)時(shí)可能產(chǎn)生的背景,我們首先將血清與轉(zhuǎn)入了pET32a(+)的大腸桿菌BL21/DE3的裂解上清進(jìn)行反復(fù)吸附,從圖4可以看出來(lái),我們采取的這種血清吸附方法效果比較理想。后續(xù)試驗(yàn)將使用腸激酶切除pET32a(+)質(zhì)粒上的 his標(biāo)簽蛋白,以獲得 Cs GST2-Cs TP22.3融合蛋白,為進(jìn)一步研究其免疫反應(yīng)性以及作為診斷抗原價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

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