宮航宇，綦盛麟，石 銘，宋連平

大連市第六人民醫(yī)院，遼寧大連 116031

據(jù)估計每年大約有3.5億人感染慢性乙肝，乙肝攜帶者有更高的風險發(fā)展成為肝硬化、肝功能失代償和肝癌[1-2]。治療這些患者的長期目標是阻止他們發(fā)展成為肝硬化和肝癌。然而這個長期目標在臨床上是不實用的。在治療后1年或更短時間的跟蹤中，通常采用更加切實可行的短期目標。較為廣泛應用的短期目標是血清ALT水平的復常和血清HBV-DNA水平的降低[3-4]。這些指標反映了肝臟生化水平的改善和病毒復制的抑制。

目前用于治療慢性乙肝和療效觀察的藥物主要分為兩大類：免疫調(diào)節(jié)劑和核苷類似物。α-干擾素是最為熟知的免疫調(diào)節(jié)劑，拉米夫定是研究最深入的核苷類似物藥物[5]。干擾素在白種人身上較為有效，而用于亞洲人則差強人意。拉米夫定對于血清ALT水平的復常、e抗原轉(zhuǎn)陰、血清HBVDNA的下降都很有效。然而長期拉米夫定治療會導致HBV聚合酶基因YMDD基序突變的產(chǎn)生[6-8]。隨著突變病毒株的產(chǎn)生，對拉米夫定治療越來越有耐藥性。在許多研究中，拉米夫定和α-干擾素聯(lián)合用藥被用于克服治療中耐藥性的產(chǎn)生，并且這種療法可以減少或延遲YMDD突變的產(chǎn)生。拉米夫定和α-干擾素序貫治療可以誘導對α-干擾素單獨治療無應答的患者產(chǎn)生持續(xù)的病毒應答。同時又不會引起耐藥突變株的優(yōu)勢選擇。序貫聯(lián)合治療可以誘導e抗原陰性HBVDNA陽性的乙肝患者產(chǎn)生持續(xù)的病毒應答。與聯(lián)合治療相比，對乙肝患者采用拉米夫定和α-干擾素序貫治療的有效性仍需進一步探索。

本研究中，筆者評價了拉米夫定和α-干擾素序貫治療e抗原陰性乙肝患者的功效，還采用了一種基于Taqman技術(shù)的實時PCR方法調(diào)查治療過程中的拉米夫定突變。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究進行于2002年6月～2004年7月，共有162例未經(jīng)抗病毒治療的患者進行了該序貫治療的研究。所有患者均＞16 歲，平均年齡（34.0±11.2）歲；其中，男 108 例，女 54例；HBsAg持續(xù)陽性至少6個月、HBeAg陰性、anti-HBe陽性、HBV-DNA水平＞105copies/ml，血清ALT水平高于正常范圍的1.5倍，小于10倍（根據(jù)中國拉米夫定應用專家共識）?；颊吲懦龢藴拾ㄒ腋闻c甲、丙、丁、戊肝以及HIV共感染者、失代償性肝病或者肝癌患者、1年內(nèi)有酒精或毒品濫用史者、其他可能引起慢性肝損傷的原因以及經(jīng)過治療的乙肝患者。

患者治療前的基本信息見表1。98例患者根據(jù)隨機安排接受拉米夫定治療，64例患者接受拉米夫定和α-干擾素的序貫治療。

1.2 研究設計和治療方案

按照2∶3的比例將患者隨機分為兩組。A組64例接受序貫治療，B組98例接受拉米夫定單獨治療。本研究按照Helsinki指南和GCP條例進行，所有的患者均被告知并表示同意。

表1 患者基本信息

A組患者接受拉米夫定（100 mg/d，葛蘭素）治療20周，然后用α-2b干擾素（500萬U，每周3次，先靈葆雅）和拉米夫定（100 mg/d）聯(lián)合治療4周，然后再用α-2b干擾素（500萬U，每周3次）單獨治療24周。B組患者每日接受100 mg的拉米夫定單獨治療持續(xù)48周。在48周治療結(jié)束后，所有患者均繼續(xù)治療24周。

1.2 YMDD突變的檢測

YMDD突變檢測采用我們所創(chuàng)建的一種基于Taqman技術(shù)的實時PCR，每隔12周進行一次。在本研究中，我們設計了3個不同的反向引物，可以選擇性擴增YMDD（野生型）、YVDD（rtM204V）和 YIDD（rtM204I）以及一個共同的位于HBV聚合酶基因高度保守序列上的正向引物，從而有效區(qū)別三種不同的病毒株。擴增子通過一個設計在正向和反向引物之間與高度保守序列互補的Taqman探針在進行實時PCR過程中得到定量檢測。一個通用的正向引物被用于擴增所有類型的病毒株作為對照。擴增體系先在50℃反應2 min，然后95℃反應5 min，然后是40個PCR循環(huán)：94℃反應20 s，53℃反應30 s。擴增在ABI 7000儀器上進行。

1.3 ALT水平、HBV標志物和HBV-DNA檢測

ALT 水平 、HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe 和 anti-HBc采用商品試劑盒每隔30 d檢測1次。HBV-DNA水平的檢測采用復星診斷的試劑盒在ABI 7000儀器上進行。所用試劑盒均經(jīng)過SFDA批準用于臨床體外檢測。

1.4 療效評價

療效評價針對本研究中所有隨機招募的患者進行。本研究中有兩項基本的評價指標。一項是在72周時進行，ALT水平的復常和HBV-DNA水平被抑制至低于1 000 copies/ml的患者比例。

第二項評價指標是在72周時測定患者中HBsAg消失或HBsAg血清轉(zhuǎn)換（定義為HBsAg的消失和anti-HBs的出現(xiàn)）的比例。

1.5 統(tǒng)計學分析

兩組間的差異性分析采用χ2檢驗進行統(tǒng)計。顯著性水平設為 P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 生化應答

在 24周后，A組 64例患者中血清 ALT復常 28例（44%），B組98例患者中72例（73%）復常。然而在48周后A組中38例（59%）復常，B組中只有54例（55%）保持了持續(xù)的生化應答。在24周時B組中ALT水平復常的比例（73%）明顯高于 A 組（44%）（P＜0.05），而在 48 周時，兩組間沒有明顯區(qū)別。在72周時，A組中ALT水平復常的比例（53%）明顯高于 B 組（36%）。

2.2 病毒應答

在24周時，A組HBV-DNA水平小于1 000 copies/ml的比例為81%，B組為78%；而在48周時，A組為56%，B組為55%。兩組在血清HBV-DNA抑制方面沒有明顯差異。在72周時，A組中HBV-DNA水平＜1 000 copies/ml的有9例（14%），B 組有 18例（18%），見表 2。

2.3 HBsAg應答

在72周時，HBsAg消失或血清轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)兩組均未進行檢測確定。

表2 治療24周、48周和72周時患者的病毒學和生化應答[n(%)]

2.4 拉米夫定耐藥突變

沒有患者有證據(jù)表明在治療前發(fā)生了拉米夫定耐藥突變。所有的患者每隔12周進行1次拉米夫定突變檢測。A組在24周時，只有2例患者發(fā)現(xiàn)有YIDD突變，在48周時沒有患者檢出YMDD突變。這2例發(fā)生YIDD突變的患者在48周和72周時ALT水平復常且HBV-DNA未檢出。相比之下，B組中在24周時有6例發(fā)生YMDD突變 （4例YIDD突變，2例YVDD突變）。48周時檢出22例患者發(fā)生突變（12例YIDD突變，8例YVDD突變，2例I/V混合突變）。所有的22例發(fā)生突變的患者在48周時都發(fā)生血清HBV-DNA的反彈，18例發(fā)生了ALT水平的反彈。

2.5 不良反應

拉米夫定具有良好的耐受性且治療中未產(chǎn)生不良癥狀。在使用干擾素的過程中，6例患者有嚴重的不良反應，包括發(fā)熱、疲勞、肌痛和頭痛。本研究中未發(fā)現(xiàn)有抑郁癥狀的患者。治療過程中，中性粒細胞和血小板數(shù)量下降，但是在治療結(jié)束后很快又恢復到基準水平。所有患者都完成了全部治療過程。

3 討論

慢性乙肝患者單獨用α-干擾素治療的長期效果不佳，很可能是由于早期機體感染的乙肝病毒所誘導出的對HBV的免疫耐受所致[7-8]。用拉米夫定和α-干擾素序貫治療對于單獨用干擾素無應答的慢性乙肝患者較為有效，主要原因可能是拉米夫定誘導的T細胞對HBV清除活性的恢復和HBV-DNA水平的降低，從而提高了α-干擾素的治療功效[9-10]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)對于HBeAg陰性患者采用先用拉米夫定后用α-干擾素序貫治療可以使其產(chǎn)生有效應答，而且在治療中拉米夫定耐藥突變能得以有效抑制。在治療結(jié)束時，序貫治療的64例患者未發(fā)現(xiàn)YMDD突變，而拉米夫定單獨治療的98例患者中有22例產(chǎn)生YMDD變異。

拉米夫定長期用藥會誘導YMDD變異的產(chǎn)生，有時還伴隨著嚴重的肝炎癥狀。以往的研究表明，拉米夫定和α-干擾素序貫治療能誘導α-干擾素單獨用藥無應答者產(chǎn)生持續(xù)的病毒應答，同時不會產(chǎn)生拉米夫定耐藥突變選擇[11-12]。二者聯(lián)合用藥以及序貫治療非常有效，而且能夠延遲拉米夫定耐藥突變選擇。最近的研究表明一種針對年輕乙肝患者的分三個階段的拉米夫定和α-干擾素序貫治療能夠降低HBVDNA水平，但是不能阻止拉米夫定耐藥突變的產(chǎn)生。在我們的研究中，接受拉米夫定和干擾素序貫治療的患者中56%在治療結(jié)束時血清HBV-DNA轉(zhuǎn)陰。拉米夫定單獨治療的患者中55%轉(zhuǎn)陰。序貫治療小組中未發(fā)現(xiàn)有拉米夫定變異，拉米夫定單獨治療組中有22.45%的患者發(fā)生YMDD變異。這些發(fā)現(xiàn)與以往的聯(lián)合用藥治療研究結(jié)果相一致。序貫治療看起來更加有效，并且能抑制拉米夫定耐藥突變的產(chǎn)生。

2例患者在序貫治療24周時發(fā)生YIDD突變，但是在48周和72周時，ALT水平復常且血清HBV-DNA未檢出。變異在拉米夫定治療12～24周時產(chǎn)生，在換用α-干擾素治療后消失。這表明α-干擾素可能對于一些拉米夫定變異患者是有效的。

在24周時，A組的ALT水平比B組高，這可能是由于添加用藥α-干擾素引起了21例患者的ALT水平升高。在這21例患者中，6例在72周時表現(xiàn)出持續(xù)的生化和病毒應答。筆者不能下結(jié)論說在α-干擾素治療開始時ALT水平的升高延長了應答期。然而在72周時序貫治療組產(chǎn)生了更高的生化應答率。這可能是由于α-干擾素對于血清ALT水平復常起了重要作用。

本研究的主要不足在于缺少組織學應答的數(shù)據(jù)。在其他研究中，有較長病毒應答的患者會有組織學上的明顯改善。在組織學活性改善與延長的生化和病毒應答之間有著較強的聯(lián)系。B組中男性比例比A組高，這可能引起治療功效評價的一些偏差，而且，本研究中持續(xù)應答率較低是由于治療時間相對較短。以后的研究中需要對更長時間的治療進行評估。

與聯(lián)合治療相比，序貫治療更加經(jīng)濟。在中國，α-干擾素較為便宜，24周的治療大約花費3 000元，而48周的拉米夫定治療大約花費6 000元。中國是世界上的乙肝大國，由于收入有限，大多數(shù)中國人將從廉價的治療方案中受益。到目前為止，中國藥監(jiān)局已經(jīng)批準了5種用于慢性乙肝治療的藥物，分別是α-干擾素、拉米夫定、阿德福韋、PEGα-2a-干擾素和恩替卡韋。這些藥物在藥品管理、有效期、治療功效、耐藥性和治療成本方面都存在很大不同[4,13]。雖然恩替卡韋在不存在拉米夫定耐藥突變時有很好的療效，拉米夫定由于其價格低廉在中國仍然會被保留下來用于治療。我們的結(jié)果表明拉米夫定和α-干擾素對于HBeAg陰性患者的序貫治療與拉米夫定單獨治療同樣有效，而且能夠有效抑制YMDD突變的產(chǎn)生。對于慢性乙肝序貫治療的時機和管理以及不同藥物的采用仍需做進一步的研究。

[1]Lee W.Hepatitis B virus infection [J].N Engl J Med,1997,337(45):1733-1745.

[2]Beasley RP.Hepatitis B virus:the major etiology of heap tocellular carcinoma[J].Cancer,1988,61(10):1942-1956.

[3]Yuen MF,Lai CL.Treatment of chronic hepatitis B [J].Lancet Infect Dis,2001,11(3):232-241.

[4]Marcellin P,Lau GK,Bonino F,et al.Peginterferon alfa-2a alone,lamivudine alone,and the two in combination in patients with HBeAgnegative chronic hepatitis B[J].N Engl JMed,2004,351:1206-1217.

[5]Averett DR,Masson WS.Evaluation of drugs for antiviral activity against hepatitis B virus[J].Viral Hepat Rev,1995,12(3):129-142.

[6]Wong DK,Cheung AM,O′Rourke K,et al.Effect of alpha-interferon treatment in patients with hepatitis B e ntigenpositive chronic hepatitis B.A meta-analysis[J].Ann Intern Med,1993,119(33):312-323.

[7]Lok AS,Chung HT,Liu VW,et al.Long-term follow-up of chronic hepatitis B patients treated with interferon alfa [J].Gastroenterology,1993,105(234):1833-1838.

[8]Lok AS,Lai CL,Wu PC,et al.Treatment of chronic hepatitis B with interferon:experience in Asian patients [J].Semin Liver Dis,1989,9(26):249-253.

[9]Serfaty L,Thabut D,Zoulim F.et al.Sequential treatment with lamivudine and interferon monotherapies in patients with chronic hepatitis B not responding to interferon alone:results of a pilot study[J].Hepatology,2001,34(26):573-577.

[10]Boni C,Bertoletti A,Penna A,et al.Lamivudine treatment can restore T cell responsiveness in chronic hepatitis B[J].JClin Invest,1998,102(362):968-975.

[11]Lai CL,Dienstag J,Sshiff E.Prevalence and clinical correlates ofYMDD variants during lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B[J].Clin Infect Dis,2003,36(6):687-696.

[12]Liaw YF,Chien RN,Yeh CT,et al.Acute exacerbation and hepatitis B virus clearance after emergence of YMDD motif mutation during lamivudine therapy[J].Hepatology,1999,30(2):579-581.

[13]Lau GK,Piratvisuth T,Luo KX,et al.Peginterferon alfa-2a,lamivudine,and the combination for HBeAg-positive chronic hepatitis B[J].N Engl JMed,2005,352:2682-2695.