趙紅玉 李 穎

1.甘肅省靈臺(tái)縣疾病預(yù)防控制中心，甘肅靈臺(tái) 744400；2.甘肅省平?jīng)鍪械诙嗣襻t(yī)院，甘肅平?jīng)?744000

目前我國(guó)HIV抗體篩查實(shí)驗(yàn)室都采用ELISA法檢測(cè)血清樣品中HIV抗體，而血清在常溫下存放容易變質(zhì)；雖然用濾紙干血斑樣品便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，但因樣品載量?。總€(gè)濾紙片載體僅容納50～100 μL血清），其應(yīng)用范圍受到限制。選擇何種載體既具有較大的樣品載量，以便進(jìn)行多項(xiàng)目檢測(cè)，又便于在常溫下容易儲(chǔ)存和運(yùn)輸；又用何種方法檢測(cè)這種特殊載體的HIV抗體，這是本研究要探討的兩個(gè)問(wèn)題。醫(yī)用脫脂棉柔軟膨松，吸水性極強(qiáng)，有容易獲得，是血清樣品的最佳載體。將血清滴于干棉球上制成干血棉球，具有較大的血清容量（每克棉球可吸納約200～400 μL血清），儲(chǔ)存和運(yùn)輸都比較方便，而且樣品的前處理也非常容易。為研討干血棉球代替血清樣品檢測(cè)HIV抗體的可行性，筆者用ELISA法對(duì)298份干血棉球與相同血清樣品進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)對(duì)比。為彌補(bǔ)干血棉球處于較高溫度、儲(chǔ)存較長(zhǎng)時(shí)間可能會(huì)引起HIV抗體陽(yáng)性樣品OD值降低，導(dǎo)致弱陽(yáng)性出現(xiàn)假陰性結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)又對(duì)檢測(cè)干血棉球HIV抗體的ELISA法進(jìn)行改進(jìn)，以提高檢測(cè)方法的靈敏度。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

HIV抗體陽(yáng)性樣品來(lái)自筆者所在縣隨訪管理的艾滋病患者和HIV感染者及用HIV抗體陰性血清稀釋HIV抗體陽(yáng)性血清制成的弱陽(yáng)性樣品，共100份，其中S/CO比值在1～3的弱陽(yáng)性樣品20份；HIV抗體陰性樣品為自愿咨詢檢測(cè)及公共場(chǎng)所從業(yè)人員，共198份。

1.1.1 血清樣品制備 采集靜脈血5 mL，室溫放置2 h，自然凝固后3 000 r/min離心15 min分離血清，置-20 ℃保存使用。

1.1.2 干血棉球 器材:干棉球[2]，在具有圓形凹槽塑料膜一面，固定一個(gè)或幾個(gè)適當(dāng)大小的醫(yī)用脫脂棉球作為血清樣品的載體，在紙殼板的另一面可注明樣品來(lái)源、檢測(cè)目的、采血日期等項(xiàng)目。

制備：將血清樣品200 μL滴于1個(gè)棉球載體上，每份血清可滴于一至數(shù)個(gè)棉球載體，37℃干燥過(guò)夜，干燥器干燥后后置密封袋中，即為干血棉球。37℃儲(chǔ)存3周。

1.2 試劑

珠海麗珠試劑股份有限公司生產(chǎn)，ELISA法檢測(cè)HIV-1/HIV-2抗體試劑，批號(hào)為2010100708。

1.3 儀器

美國(guó)產(chǎn)Stat Fax 2 100型全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀，美國(guó)產(chǎn)Stat Fax 2 600型洗板機(jī)。

1.4 方法

1.4.1 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作 采用450/630 nm雙波長(zhǎng)，不設(shè)空白對(duì)照。用美國(guó)產(chǎn)Stat Fax 2 100型全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀比色，結(jié)果以說(shuō)明書(shū)給定參考值設(shè)置的酶標(biāo)儀判斷結(jié)果為準(zhǔn)。

1.4.2 干血棉球樣品處理液 取含有200μL血清樣品的干血棉球置于試管中，加生理鹽水200μL，混勻，溶解20～30 min，3 000 r/min離心15 min,取上清液（樣品處理液）備用。

1.4.3 改進(jìn)ELISA 在ELISA法中，第1步加入陰性、陽(yáng)性對(duì)照，待檢樣品由50μL改為100μL，溫育時(shí)間由30 min改為60 min；其他步驟和試劑用量同試劑說(shuō)明書(shū)。

1.4.4 20份37℃儲(chǔ)存3周S/CO 比值在1～3的弱陽(yáng)性血清，按ELISA說(shuō)明書(shū)和改進(jìn)ELISA兩種方法檢測(cè)。

2 結(jié)果

298份血清樣品用ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)，HIV抗體陽(yáng)性100份；經(jīng)37℃儲(chǔ)存3周的298份相同血清干血棉球樣品處理液，用改進(jìn)ELISA方法檢測(cè)，HIV抗體陽(yáng)性99份。兩種樣品HIV抗體檢測(cè)結(jié)果符合率為99.0 %，經(jīng)x2檢驗(yàn)，相同的血清干血棉球與血清樣品檢測(cè)結(jié)果之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩種方法檢測(cè)相同血清樣品HIV抗體結(jié)果比較

20份S/CO值在1～3的HIV抗體弱陽(yáng)性樣品，其37℃儲(chǔ)存3周的干血棉球樣品處理液用ELISA法檢測(cè)，HIV抗體陽(yáng)性11份，而用改進(jìn)ELISA檢測(cè)，HIV抗體陽(yáng)性20份。經(jīng)x2檢驗(yàn)，兩種檢驗(yàn)方法結(jié)果有所不同（P＜0.05）；說(shuō)明用ELISA法檢測(cè)37℃儲(chǔ)存3周的干血棉球樣品處理液，有部分弱陽(yáng)性樣品出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而用ELISA改進(jìn)方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。見(jiàn)表2。

表2 干血棉球用說(shuō)明書(shū)和用改進(jìn)方法檢測(cè)HIV抗體弱陽(yáng)性結(jié)果比較

3 討論

干血棉球樣品處理液在37℃儲(chǔ)存3周，用改進(jìn)ELISA檢測(cè)HIV抗體，與相同血清樣品按ELISA法說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)結(jié)果比較，兩種樣品HIV抗體檢測(cè)結(jié)果符合率為 99%，經(jīng)x2檢驗(yàn)，兩種檢驗(yàn)方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干血棉球集合了血清樣品和濾紙片樣品二者的優(yōu)點(diǎn)，既有容量大、易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，也可用干血棉球代替血清樣品用于HIV抗體的檢測(cè)。

37℃儲(chǔ)存3周的干血棉球，會(huì)引起HIV抗體活性降低，用生理鹽水溶解，又會(huì)引起HIV抗體濃度降低，HIV抗體弱陽(yáng)性樣品，按ELISA檢測(cè)，會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果；但通過(guò)對(duì)ELISA方法稍作改進(jìn)，即增加待檢樣品量（50～100 μL），同時(shí)延長(zhǎng)抗原-抗體反應(yīng)（溫育）時(shí)間（30～60 min），可避免這一現(xiàn)象發(fā)生。用改進(jìn)ELISA檢測(cè)干血棉球與相同血清樣品按試劑說(shuō)明書(shū)檢測(cè)結(jié)果比較，經(jīng)x2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；改進(jìn)ELISA在實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟與試劑盒說(shuō)明書(shū)完全相同，可用改進(jìn)ELISA檢測(cè)干血棉球HIV抗體。

[1] 張俊平,馬改娣,張孟尚,等.抗人球蛋白法與酶法檢測(cè)ABO血型免疫抗體效價(jià)的比較[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47（30）：59.

[2] 孔繁生.一種保存干燥血清標(biāo)本的器具：中國(guó)，200520028244 [P].2006-04-05.