馮秀梅 王 艷

吉林省吉林市紅十字中心血站，吉林吉林 132001

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)已有部分血站使用NAT篩查獻(xiàn)血者。根據(jù)我國(guó)現(xiàn)行的法定要求，采供血機(jī)構(gòu)對(duì)獻(xiàn)血者病毒血清學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目主要為HBsAg、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP，ELISA方法檢測(cè)[1]的篩查模式已極大地降低了輸血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，但因輸血而患傳染病的情況仍然時(shí)有發(fā)生[2]，主要因?yàn)槲覈?guó)屬于肝炎的高發(fā)區(qū)，人群中HBsAg攜帶率為9.09%，HBV流行率＞60%[3]， 抗-HCV陽(yáng)性率也達(dá)到了3.2%[4]，艾滋病也有快速發(fā)展的趨勢(shì)。現(xiàn)有的血清學(xué)方法避免不了對(duì)病毒感染“窗口期”的漏檢，而近年來(lái)發(fā)展的高度敏感、特異的核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）可使HBV、 HCV和 HIV病毒的“窗口期”明顯縮短[5]，大大提高了輸血和血液制品的安全。現(xiàn)將筆者所在血站2010年12月～2011年7月ELISA檢測(cè)陰性獻(xiàn)血者的標(biāo)本進(jìn)行NAT檢測(cè)的情況報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

2010年12 月～2011年7月采集的無(wú)償獻(xiàn)血者全血標(biāo)本中，經(jīng)ELISA方法檢測(cè)陰性的標(biāo)本共18 751份，其中男10 230人，女8 521人。采血后用3支5 mL EDTA抗凝真空試管（其中兩支帶分離膠，1管不帶分離膠），保存于2～8℃冰箱，24 h內(nèi)分離血漿，1管不帶分離膠的用于免疫4項(xiàng)、ALT、血型等檢測(cè)，1管帶分離膠的用于NAT檢測(cè)，另外1管用于標(biāo)本保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器

Roche Cobas S201全自動(dòng)核酸提取、擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)，Hamilton star全自動(dòng)混樣儀，Cobas Ampilprep核酸提取儀，Cobas Taqmen Analyzer核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀，F(xiàn)ame24/20酶免分析儀，F(xiàn)reedom evo clinical全自動(dòng)加樣儀，elecsys 2010電化學(xué)發(fā)光分析儀，KUBOTA 8420低速離心機(jī)，MPR-141OR冰箱。

1.3 試劑

ELISA 篩查試劑：HBsAg（上?？迫A、廈門新創(chuàng)），HCV（上?？迫A、廈門新創(chuàng)），HIV（珠海麗珠、北京萬(wàn)泰）。NAT試劑：核酸定性篩查試劑盒（Cobas TaqScreen MPX test）。確證試劑：HIV、HCV、HBV（COBAS Ampliprep/ COBAS TaqMan），elecsys 2010電化學(xué)發(fā)光分析儀配套試劑。以上所使用的試劑均為國(guó)家生物檢定所批批檢定合格，且在有效期內(nèi)使用。

1.4 方法

將用ELISA方法檢測(cè)陰性的標(biāo)本，再用全自動(dòng)加樣儀和全自動(dòng)核酸提取、擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行混樣檢測(cè)，每一級(jí)混樣池包含6個(gè)獻(xiàn)血者標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本取167 mL血漿至一級(jí)混樣池，用全自動(dòng)混樣議加樣，一級(jí)混樣池標(biāo)本采用Cobas TaqScreen MPX test試劑，在全自動(dòng)核酸提取儀中應(yīng)用MGP磁珠分離技術(shù)原理提取核酸，核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀擴(kuò)增檢測(cè)HBV、 HCV和 HIV靶序列，在Cobas S201系統(tǒng)服務(wù)器中自動(dòng)判讀結(jié)果，每組檢測(cè)均設(shè)置質(zhì)控對(duì)照（HBV/HCV/HIV-1-O/ HIV-1-M/ HIV-2），每個(gè)一級(jí)混樣池均含內(nèi)對(duì)照，全自動(dòng)核酸提取、擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)檢出的陽(yáng)性一級(jí)混樣池拆分為6個(gè)組，組成該一級(jí)混樣池的原始標(biāo)本做單標(biāo)本檢測(cè)，單標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性判定為NAT陽(yáng)性，單標(biāo)本檢測(cè)陰性判定為NAT陰性。

1.5 確證實(shí)驗(yàn)

將NAT檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本，再以另一種NAT試劑做單標(biāo)本檢測(cè)，乙肝五項(xiàng)（HBsAg、抗 -HBs、、HBeAg、抗 -HBe、抗 -HBc）送至北華大學(xué)附屬醫(yī)院用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。

表1 NAT檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本分項(xiàng)確證試驗(yàn)

2 結(jié)果

2.1 NAT檢測(cè)情況

經(jīng)ELISA法篩查陰性的標(biāo)本18 751份進(jìn)行NAT檢測(cè)，共篩查出陽(yáng)性標(biāo)本15份，陰性標(biāo)本18 736份，陽(yáng)性檢出率為0.08%（因羅氏血篩試劑是HIV、HCV和HBV 3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)，尚不能區(qū)分具體項(xiàng)目）。

2.2 NAT檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本分項(xiàng)確證情況

將Cobas S201系統(tǒng)檢出的15份陽(yáng)性標(biāo)本用另一種核酸檢測(cè)系統(tǒng)做確證試驗(yàn)，進(jìn)行分項(xiàng)鑒別，其中有4份未檢測(cè)到HBVDNA、HCV-RNA、HIV-RNA，11份標(biāo)本檢測(cè)出HBV-DNA陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為73.3%（11/15）。見(jiàn)表1。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，18 751份陰性標(biāo)本經(jīng)Cobas S201系統(tǒng)檢測(cè)后有15份為陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為0.08%。用確證檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性為11份，陰性4份。Cobas S201系統(tǒng)檢測(cè)的病毒類型主要是HBV、HCV及HIV-1-O、HIV-1-M、HIV-2型，確證核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢出的病毒型主要是HBV、HCV和HIV-1-O型，根據(jù)2個(gè)系統(tǒng)各自的工作原理，4份標(biāo)本確證核酸檢測(cè)系統(tǒng)未檢出，不排除屬于HIV-1-M、HIV-2型的可能[6]，又因筆者采用的是集中進(jìn)行分項(xiàng)鑒別試驗(yàn)的模式，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中標(biāo)本保存須經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融或分裝，病毒RNA對(duì)溫度變化和環(huán)境中的RNA酶較敏感[7]相對(duì)比較容易降解，4份陰性標(biāo)本不排除有這種可能性。對(duì)經(jīng)分項(xiàng)鑒別試驗(yàn)確認(rèn)的11份HBV陽(yáng)性標(biāo)本的乙肝五項(xiàng)檢測(cè)，HBsAg雖陰性，但抗-HBe、HBeAg或抗-HBc陽(yáng)性的標(biāo)本共6份，其比率較高。據(jù)報(bào)道，我國(guó)普通人群和無(wú)償獻(xiàn)血人群的抗-HBe、HBeAg或抗-HBc的總體陽(yáng)性概率為10%左右[8]，筆者統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)可認(rèn)為是NAT陽(yáng)性標(biāo)本的病毒攜帶風(fēng)險(xiǎn)大于NAT陰性標(biāo)本的原因。

Cobas S201系統(tǒng)為美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于獻(xiàn)血者的血液篩查系統(tǒng)，采用磁珠捕獲的方法提取分離靶核酸片段，并以實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)血液標(biāo)本的核酸濃度。本實(shí)驗(yàn)NAT檢測(cè)采用混樣池檢測(cè)模式，將6份常規(guī)檢測(cè)陰性標(biāo)本各取167 mL，混合至1個(gè)待測(cè)樣本管進(jìn)行檢測(cè)，可以檢測(cè)出較微量的HBV DNA、HCV RNA及HIV RNA，靈敏度較高。在HBV、HCV和HIV的檢測(cè)中，HBV陽(yáng)性檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于HCV和HIV，乙型肝炎是經(jīng)血傳播危害嚴(yán)重的病毒性傳染病，每年新發(fā)病例50萬(wàn)[9]。目前在對(duì)乙肝病毒的篩查中，我國(guó)仍以HBsAg陽(yáng)性與否作為篩查獻(xiàn)血者HBV感染的指標(biāo)，HBV感染后最先存在血清中是HBV DNA，就算用靈敏度較高的ELISA試劑檢測(cè)抗原抗體也要經(jīng)過(guò)50～80 d的“窗口期”[10]，因此ELISA方法對(duì)“窗口期”的漏檢不能消除。在發(fā)達(dá)國(guó)家，如美國(guó)經(jīng)過(guò)10多年利用NAT檢測(cè)血液中的HIV和HCV，無(wú)償獻(xiàn)血者HCV RNA和HIV RNA陽(yáng)性率下降至1/222 200和1/2 200 000[11]。自1993年起，歐美、日本以及我國(guó)香港等近20個(gè)國(guó)家和地區(qū)用NAT技術(shù)做獻(xiàn)血者血液篩查，研究表明，通過(guò)NAT檢測(cè)，可以將輸血傳播HBV、HCV和HIV的ELISA方法檢測(cè) “窗口期”分別縮短25、59和11 d[12]。

從筆者所在血站的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可以看出，ELISA方法檢測(cè)陰性的標(biāo)本，用NAT系統(tǒng)檢測(cè)后，仍有0.08%的陽(yáng)性檢出率，其他城市如北京、深圳、青島、常州等血站的報(bào)道也闡明了NAT技術(shù)更為敏感的觀點(diǎn)，可以篩查出尚屬于“窗口期”的樣本，能夠大大提高輸血安全系數(shù)。

[1]獻(xiàn)血者健康檢查要求.中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 18467-2001[S].中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，2002-03-01.

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