湯俊琪，龐廣昌*，梁新義，馮蒼松

基于殼聚糖-納米金修飾的酪蛋白免疫傳感器的研制

湯俊琪，龐廣昌*，梁新義，馮蒼松

(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

在玻碳電極表面修飾殼聚糖和納米金，以納米金對(duì)抗體等生物分子的良好親和性，固定抗-αs-酪蛋白(antiαs-酪蛋白)抗體制得酪蛋白免疫傳感器。通過(guò)循環(huán)伏安法考察電極表面的電化學(xué)特性，并對(duì)該免疫傳感器的性能進(jìn)行研究。該免疫傳感器對(duì)以磷酸鹽緩沖液溶解的αs-酪蛋白進(jìn)行檢測(cè)。響應(yīng)電流與酪蛋白抗原質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)在1～10000ng/mL的范圍內(nèi)線性相關(guān)。該免疫傳感器制作簡(jiǎn)單，成本較低，操作方便，可應(yīng)用于牛奶質(zhì)量和非乳蛋白摻雜使假的檢測(cè)。

免疫傳感器；殼聚糖；納米金；酪蛋白；計(jì)時(shí)電流法；生物傳感器；玻碳電極；循環(huán)伏安法

殼聚糖(chitosan，CHIT)是天然高分子聚合物甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物，價(jià)格低廉，來(lái)源廣泛，具有可降解性、良好的成膜性、良好的生物相容性、很好的化學(xué)修飾能力等性能[1-3]。近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于生物傳感器中做為酶、抗體等生物大分子的固定材料。納米金溶膠又叫膠體金(nano-gold，NG)，其表面活性位點(diǎn)較多，吸附力強(qiáng)，表面反應(yīng)活性高，對(duì)生物分子具有較好的親和性[4]。能和生物分子中的-SH、-NH2、-CN等功能基團(tuán)相互作用，并通過(guò)靜電吸附，形成Au -S共價(jià)鍵等方式將抗體、酶等生物分子固定而不影響其生物活性，在生物傳感器的制作中被普遍使用[5-7]。對(duì)于殼聚糖-納米金復(fù)合材料仿生膜構(gòu)造新型生物傳感器，并應(yīng)用于臨床、醫(yī)藥、環(huán)境、食品、化工等領(lǐng)域，一直是生物傳感器領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

牛奶已經(jīng)由個(gè)別群體的營(yíng)養(yǎng)保健品轉(zhuǎn)變?yōu)榇蟊娛称?，特別是嬰幼兒和老年人的高營(yíng)養(yǎng)食品，其質(zhì)量安全是人命關(guān)天的大事。牛乳蛋白質(zhì)中大約80%是酪蛋白，其中αs-酪蛋白質(zhì)量濃度15～19g/L，它一般不受季節(jié)、飼料的影響，濃度恒定，且結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。檢測(cè)αs-酪蛋白的含量，就可判斷乳品是否摻假[8-10]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)牛奶中酪蛋白的測(cè)定研究，主要有疏水層析法[11]、毛細(xì)管電泳法[12]、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法[13]等方法。為簡(jiǎn)化測(cè)定過(guò)程，縮短測(cè)定時(shí)間，降低測(cè)定成本等，Hiep等[14]利用局部表面等離子體共振法(localized surface plasmon resonance，LSPR)的免疫傳感器對(duì)酪蛋白進(jìn)行測(cè)定研究。本實(shí)驗(yàn)利用殼聚糖-納米金復(fù)合材料仿生膜固定抗-αs-酪蛋白(anti-αs-酪蛋白)抗體制作了簡(jiǎn)易的新型電流型免疫傳感器，采用免疫競(jìng)爭(zhēng)法對(duì)以磷酸鹽緩沖液溶解的anti-αs-酪蛋白進(jìn)行測(cè)定。該免疫傳感器制作簡(jiǎn)單，使用方便，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

anti-αs-酪蛋白(本實(shí)驗(yàn)以αs-酪蛋白免疫新西蘭大白兔，提純免疫血清獲得)；αs-酪蛋白 美國(guó)Sigma公司；氯金酸 天津科密歐儀器公司；殼聚糖(脫乙酰度90%) 濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司。

1g/100mL殼聚糖溶液：1g殼聚糖溶于100mL 體積分?jǐn)?shù)1%的醋酸溶液中；H2O2(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%) 廣州化學(xué)試劑廠；K3Fe(CN)6；乙醇胺；磷酸鹽緩沖液(PBS，稱取KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，雙蒸水溶解定容至1000mL)。所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

CHI760D電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司；三電極系統(tǒng)：工作電極為玻碳電極(GCE，Φ=3mm)，參比電極為Ag/AgCl電極，對(duì)電極為鉑絲電極；DK-8B型電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超聲洗滌儀 昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司。

1.2 納米金的制備

納米金由檸檬酸鈉在微波爐中還原獲得。100mL 0.1g/L的氯金酸溶液在微波爐中先高檔沸騰2min。迅速一次加入4mL 1g/100mL檸檬酸三鈉水溶液，再放入微波爐中，中擋保持3min，得到透明的酒紅色溶液，即為15nm左右的納米金[15]。

1.3 免疫傳感器的制作

1.3.1 玻碳電極的預(yù)處理

玻碳電極用a-Al2O3(粒度0.03μm)懸濁液拋光，雙蒸水沖洗，于雙蒸水中超聲15s清洗干凈，在1mmol/L K3Fe(CN)6(含0.2mol/L KNO3)溶液中以循環(huán)伏安法掃描表征，然后電極分別在7.25mol/L硝酸溶液、丙酮中懸置浸泡10min，最后在2.2mol/L HNO3與2.5g/100mL K2CrO7溶液中于+1.5V恒電位氧化1min，使玻碳電極表面生成較多的羧基(-COOH)，雙蒸水沖洗干凈，晾干備用。

1.3.2 NG/CHIT/GCE電極的制備

以微量進(jìn)樣器取5μL 1g/100mL的殼聚糖溶液滴加到處理后的玻碳電極表面，置于50℃烘箱中2h，冷卻至室溫。在50g/L NaOH溶液中浸泡5min，雙蒸水沖洗后在雙蒸水中浸泡30min，然后置于納米金溶膠中浸泡30h，每隔6h沖洗一次。最后可以看到電極表面修飾有一層金黃色的納米金膜，即得NG/CHIT/GCE電極。

1.3.3 抗體的固定

將NG/CHIT/GCE電極浸泡在用PBS pH7.0稀釋的anti-αs-酪蛋白溶液中，4℃放置過(guò)夜，取出，水洗；然后電極置于1mol/L乙醇胺中37℃溫育1h，以封閉活性基團(tuán)，以含體積分?jǐn)?shù)1% Tween-20的PBST溶液洗凈，置于4℃冰箱中保存待用。

1.3.4 自組裝過(guò)程的電化學(xué)特征

利用循環(huán)伏安法表征電極在自組裝過(guò)程中不同階段的循環(huán)伏安圖。采用三電極系統(tǒng)，免疫傳感器為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極，于1mmol/L K3Fe(CN)6(含0.2mol/L KNO3)溶液中在0.6～-0.1V電位范圍掃描，掃描速度0.05V/s。

1.3.5 免疫電極測(cè)定過(guò)程

采用計(jì)時(shí)電流法直接測(cè)量，計(jì)時(shí)電流法實(shí)驗(yàn)在PBS緩沖液中進(jìn)行計(jì)時(shí)電流法測(cè)定時(shí)，工作電位為-0.35V。

2 結(jié)果與分析

2.1 電極自組裝過(guò)程中的電化學(xué)特性

電極每次修飾后，在4mL1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]＋0.2mol/L KNO3溶液中，以0.6～-0.1V的電位范圍，0.05V/s的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定，所得CV曲線如圖1所示。

圖1 電極預(yù)處理的循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammogram of the pretreated electrode

由圖1曲線a可見(jiàn)，裸電極經(jīng)過(guò)打磨后，F(xiàn)e(CN)63-探針?lè)肿釉谄渖嫌幸粚?duì)對(duì)稱的氧化還原電流峰，峰電位為Ep,a=0.306V，Ep,c=0.234V(vs.Ag/AgCl)，Ip,a/Ip,c=1。當(dāng)電極在7.25mol/L硝酸溶液和丙酮中浸泡后，在+1.5V條件下，用2.2mol/L和2.5g/100mL K2CrO7溶液處理60s，探針?lè)肿拥倪€原峰電位(Ep,c)負(fù)移、氧化峰電位(Ep,a)正移，氧化、還原峰電流都有明顯的減小(曲線b、c)，表明電極表面的(-COOH)基團(tuán)增多，具有較高的負(fù)電荷密度，與同樣帶負(fù)電荷的Fe(CN)63-之間由于靜電作用相互排斥，阻礙Fe(CN)63-到達(dá)電極表面，從而阻止了其在電極表面的電子傳遞。曲線b、c的氧化還原電流峰的變化不是特別明顯。說(shuō)明電極表面已經(jīng)相對(duì)干凈和產(chǎn)了相對(duì)飽和的羧基基團(tuán)。電極達(dá)到預(yù)處理的要求。

當(dāng)電極逐層修飾上殼聚糖和納米金后，氧化、還原峰電流都有明顯的增大(圖2曲線c)，而剛剛修飾上殼聚糖后，由于殼聚糖對(duì)Fe(CN)63-/Fe(CN)64-的電子傳遞存在一定的阻礙作用，其氧化還原峰明顯下降(曲線a)，隨后修飾納米金，電流峰值劇增，說(shuō)明殼聚糖在電極表面形成薄層且對(duì)納米金有很好的吸附作用，曲線c明顯增大的峰電流，表現(xiàn)了納米金出色的電子傳遞能力。殼聚糖層修飾的工作電極直接浸入納米金中，往往容易脫落而進(jìn)入納米金溶膠中而且很容易使納米金溶膠變性失效，本實(shí)驗(yàn)將電極經(jīng)過(guò)NaOH溶液處理5min，然后雙蒸水沖洗干凈，很好的解決這個(gè)問(wèn)題。

圖2 玻碳電極的修飾的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammogram of the modified electrode

2.2 免疫電極的電化學(xué)特性

免疫電極同樣在4mL1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]＋0.2mol/L KNO3溶液中，以0.6～-0.1V的電位范圍，0.05V/s的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安法表征。可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)NG/CHIT/GCE電極固定有抗體后，峰電流出現(xiàn)了非常大的變化(圖3曲線c→b)。這是由于在抗體被固定到電極表面，形成了蛋白分子層，阻礙電子的傳輸(圖3曲線b)，當(dāng)電極在αs-酪蛋白溶液中浸泡后，由于酪蛋白和抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，致使峰響應(yīng)電流進(jìn)一步下降。酪蛋白質(zhì)量濃度越高，形成的免疫復(fù)合物膜就越厚。當(dāng)酪蛋白質(zhì)量濃度很高時(shí)，生成的免疫復(fù)合物使得Fe(CN)63-通過(guò)困難，峰響應(yīng)電流變得非常小(圖3曲線a)。

圖3 免疫電極和對(duì)抗原測(cè)定的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of the immunosensor andαs-casein detection

2.3 免疫電極對(duì)酪蛋白的測(cè)定

將制備好的免疫電極在空白PBS溶液中以-0.4V恒電位計(jì)時(shí)電位法進(jìn)行測(cè)定后，免疫電極分別在不同質(zhì)量濃度的酪蛋白抗原溶液中37℃水浴5min，然后在相同電位下同樣進(jìn)行計(jì)時(shí)電位測(cè)定(圖4)。選定第30秒為標(biāo)準(zhǔn)，以電流強(qiáng)度(μA)和αs-酪蛋白抗原質(zhì)量濃度(ng/mL)的對(duì)數(shù)做圖可知，對(duì)數(shù)在1～10000ng/mL的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為：I=-0.0562lgc＋1.8494，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9402。

圖4 免疫電極對(duì)不同質(zhì)量濃度的αs-酪蛋白抗原的電流響應(yīng)Fig.4 Amperometric response curves for the determination ofαs-casein

2.4 免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

將該制作好的免疫傳感器在100ng/mL αs-酪蛋白抗原溶液中反復(fù)測(cè)定4次，測(cè)定結(jié)果的RSD為3.8%(n=4)，表明該免疫傳感器具有良好的重現(xiàn)性；對(duì)于該免疫傳感器的保存方法和穩(wěn)定性能，僅將該免疫傳感器在4℃冰箱環(huán)境中干態(tài)放置，相隔24h對(duì)同質(zhì)量濃度的αs-酪蛋白抗原溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明電流響應(yīng)值產(chǎn)生了較大的漂移，只有前一次測(cè)定的79.3%，由于產(chǎn)生較大的變化未進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的保存探討，但此結(jié)果表明，一方面說(shuō)明該傳感器的穩(wěn)定性還需要進(jìn)一步的研究，另一方面尋找合適的保存方法如適當(dāng)?shù)木彌_溶液保存，或者在室溫下保存，這些還有待討論研究。以提高免疫傳感器在實(shí)際應(yīng)用中的測(cè)定能力。總體來(lái)說(shuō)，這種新型免疫傳感器的研制出現(xiàn)，為其應(yīng)用于牛奶中進(jìn)行安全檢測(cè)將提供一條嶄新的思路。

3 結(jié) 論

在玻碳電極表面修飾殼聚糖納米金仿生膜后，利用納米金對(duì)抗體具有良好的親和固定作用而制備出了一種價(jià)廉，簡(jiǎn)便的免疫傳感器。應(yīng)用該免疫傳感器對(duì)酪蛋白進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明其具有很廣的測(cè)定范圍和很低的測(cè)定極限?？蔀樘禺愋远繖z測(cè)酪蛋白以及乳品質(zhì)量與非乳蛋白摻雜使假檢測(cè)提供新的方法和思路。

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Development of Casein Immunosensor Modified by Chitosan and Nano-Gold

TANG Jun-qi，PANG Guang-chang*，LIANG Xin-yi，F(xiàn)ENG Cang-song
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

A novel casein immunosensor for detectingαs-casein was developed through the modification of chitosan and nanogold on the glassy carbon electrode. The modification procedure was electrochemically monitored by cyclic voltammetry to explore the characteristics of the electrode surface and the performance of the immunosensor. The developed immunosensor was used to detectαs-casein in phosphate buffer. An excellent linear range between response current andαs-casein concentration was observed in the concentration range of 1-10000 ng/mL. Therefore, this developed immunosensor is characteristics of simple preparation, low cost, convenient operation, and can be applied to the safety detection of milk.

immunosensor；chitosan；nano-gold；casein；chronoamperometry；biosensor；glassy carbon electrode；cyclic voltammetry

TS201；O657.32

B

1002-6630(2011)04-0280-04

2010-04-01

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD04A00)；天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(06YFJMJC12600)

湯俊琪(1984—)，男，碩士研究生，主要從事生物傳感器及電化學(xué)分析的研究。E-mail：tangjunqi1984@163.com

*通信作者：龐廣昌(1956—)，男，教授，博士，主要從事食品免疫化學(xué)及食品生物技術(shù)的研究。E-mail：pgc@tjcu.edu.cn