黎園園，董慶利*，梁 娜，胡孟晗

解凍豬肉的有害菌鑒定及其再生長(zhǎng)研究

黎園園，董慶利*，梁 娜，胡孟晗

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

采用選擇性培養(yǎng)基對(duì)-18℃凍藏5d后解凍的豬肉中有害菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，并對(duì)各選擇性培養(yǎng)基上的典型菌落進(jìn)行分離純化和初步鑒定，進(jìn)而對(duì)各種有害菌在4、0、-5℃的再生長(zhǎng)進(jìn)行研究。結(jié)果表明假單胞菌屬、熱死環(huán)絲菌、腸桿菌科是解凍豬肉中存在的優(yōu)勢(shì)有害菌。在4℃和0℃貯藏的過(guò)程中各有害菌均有增長(zhǎng)，假單胞菌和熱死環(huán)絲菌增長(zhǎng)最快，菌數(shù)最多；-5℃貯藏過(guò)程有害菌增長(zhǎng)緩慢，甚至有所減少。

解凍豬肉；有害菌；再生長(zhǎng)

解凍肉是指冷凍肉吸收熱量使肌肉組織中的冰晶融化從而達(dá)到冷凍前的新鮮狀態(tài)。冷凍肉作為肉類(lèi)儲(chǔ)備和企業(yè)加工的原材料可以在低溫狀態(tài)下儲(chǔ)存很長(zhǎng)時(shí)間，在肉的流通過(guò)程中起著重要的作用。冷凍肉在加工或食用前均需解凍，采取何種解凍方法能使解凍后肉的品質(zhì)最高，解凍后如何貯藏才能最大的保持肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官價(jià)值，以及貯藏過(guò)程中微生物變化等問(wèn)題有待研究。

對(duì)解凍肉的研究，國(guó)內(nèi)外已有不少的報(bào)道。余小領(lǐng)等[1]對(duì)不同凍結(jié)解凍速度對(duì)豬肉的保水性和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，Lee等[2]、Zhao等[3]、Li等[4]對(duì)肉類(lèi)解凍方法進(jìn)行研究，葉盛英等[5]對(duì)凍結(jié)肉噴射聲空化場(chǎng)解凍技術(shù)進(jìn)行初探。研究表明不同的解凍方法對(duì)肉的品質(zhì)如色澤、肉汁損失率等有一定的影響。對(duì)解凍肉中微生物情況，以及貯藏過(guò)程中微生物的再生長(zhǎng)規(guī)律，國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。

經(jīng)研究表明肉中的有害菌有假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、熱死環(huán)絲菌、腸桿菌科及其他致病菌如沙門(mén)氏菌[6]等。本實(shí)驗(yàn)以-18℃凍藏5d后解凍的豬肉為例研究其中有害菌的初始情況并進(jìn)行分離和初步鑒定，以及不同溫度貯藏過(guò)程中的再生長(zhǎng)變化，以期為肉類(lèi)工業(yè)質(zhì)量控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宰后48h的新鮮豬精腿肉 市購(gòu)。于實(shí)驗(yàn)室中分割成30g左右的樣品，迅速置于-18℃冰箱中凍結(jié)5d取出于空氣中自然解凍3h后備用。

PCA培養(yǎng)基(plate count agar)、PSA培養(yǎng)基(pseudomonades selective agar)、STAA培養(yǎng)基(streptomycin thalliumacetate actidion agar)、VRBGA瓊脂(violet red bile gluc agar)、MRS瓊脂(man rogosa and sharpe agar)、葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基(O/F培養(yǎng)基)和Thornley氏精氨酸雙水解酶試驗(yàn)培養(yǎng)基(thornley arginine eihydrolase test medium)的配制參見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。

革蘭氏染色液、1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺、3%～10% 過(guò)氧化氫、1% α-萘酚酒精(95%)溶液和液體石蠟；上述所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Autoclave SS-325型滅菌鍋 日本Tomy Kogyo公司；XW-80A型漩渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海華連醫(yī)療器械有限公司；ECCIPSE型顯微鏡 日本尼康公司；HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海比朗儀器有限公司；WAECO CF50型冰箱 美國(guó)電子(深圳)有限公司；SPX-250B-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱、S·SW-CJ-IC型凈化工作臺(tái) 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.3 解凍豬肉的初始有害菌計(jì)數(shù)

隨機(jī)選取3個(gè)解凍豬肉典型樣品進(jìn)行初始有害菌計(jì)數(shù)，取樣方法參照GB 4789.2—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[8]方法。初始有害菌采用選擇性培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件如表1所示。

表1 解凍豬肉中各種有害菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 Culture media and culture conditions for counting harmful bacteria in thawed pork

1.4 有害菌的分離及初步鑒定

從各選擇性培養(yǎng)基上挑取典型生長(zhǎng)菌落數(shù)株，然后在相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上反復(fù)劃線分離，得到純化的菌落。

菌落形態(tài)主要包括：分離純化得到的單個(gè)菌落的大小、形態(tài)、隆起程度、邊緣結(jié)構(gòu)、表面狀態(tài)、光澤度、透明度、質(zhì)地和顏色等。進(jìn)而挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察單個(gè)細(xì)胞的形狀和細(xì)胞間的排列方式。

不同的微生物的生理生化特征鑒定參考文獻(xiàn)[9-10]，主要包括氧化酶試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)和精氨酸雙水解試驗(yàn)等。

1.5 不同溫度貯藏下解凍豬肉的有害菌再生長(zhǎng)

將解凍后豬肉樣品分別置于4、0、-5℃條件貯藏，解凍后立即采用選擇性培養(yǎng)基傾注平板進(jìn)行各種菌落計(jì)數(shù)，并記為0d，以后每2d取樣進(jìn)行計(jì)數(shù)直至第8天。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用方差分析進(jìn)行鄧肯氏多重檢驗(yàn)分析，并用Origin 8.0軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 解凍豬肉中初始有害菌分析

采用選擇性培養(yǎng)基對(duì)3個(gè)平行的解凍豬肉樣品的菌落總數(shù)、假單胞菌屬、熱死環(huán)絲菌、腸桿菌科和乳酸菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

表2 解凍豬肉初始有害菌分析Table 2 Numbers of total viable bacteria and harmful species of bacteria in thawed pork

從表2結(jié)果可以看出，假單胞菌屬與熱死環(huán)絲菌是解凍豬肉中的優(yōu)勢(shì)有害菌，平均菌數(shù)與其他菌數(shù)差異顯著(P＜0.05)，后續(xù)的貯藏實(shí)驗(yàn)也表明這兩種優(yōu)勢(shì)菌增長(zhǎng)最快。同時(shí)，假單胞菌屬(5.68 lg(CFU/g))與熱死環(huán)絲菌(5.56 lg(CFU/g))的菌數(shù)高于了菌落總數(shù)(4.77 lg(CFU/g))，分析原因是由于PCA培養(yǎng)基不能使所有的菌都生長(zhǎng)或者未體現(xiàn)其他菌的競(jìng)爭(zhēng)性。

解凍豬肉中的優(yōu)勢(shì)有害菌其次是腸桿菌科，對(duì)數(shù)平均值為4.21lg(CFU/g)。乳酸菌數(shù)量最少，解凍豬肉中乳酸菌的存在會(huì)對(duì)優(yōu)勢(shì)有害菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用[11]。從表2結(jié)果還可以看出，菌落總數(shù)對(duì)數(shù)平均值超過(guò)了4lg(CFU/g)，有研究認(rèn)為肉中初始菌數(shù)應(yīng)控制在102～103CFU/g會(huì)利于保存[12]，本研究后續(xù)的貯藏期較短也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。有研究認(rèn)為豬肉在屠宰分割及冷凍過(guò)程中由于工藝不完善[13]和員工操作不規(guī)范等原因，會(huì)使微生物指標(biāo)超標(biāo)，影響肉的質(zhì)量，也增大了不安全因素。因此實(shí)際生產(chǎn)中不能忽略加工工藝對(duì)解凍豬肉中微生物的控制作用。

2.2 解凍豬肉中有害菌的初步鑒定

通過(guò)菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色及生理生化實(shí)驗(yàn)，對(duì)來(lái)源于PSA、STAA、VRBGA、MRS平板并經(jīng)過(guò)劃線分離得到的純菌株進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果如表3所示。

表3鑒定結(jié)果可以進(jìn)一步說(shuō)明假單胞菌屬、熱死環(huán)絲菌和腸桿菌科是解凍豬肉中的優(yōu)勢(shì)有害菌。

表3 解凍豬肉中優(yōu)勢(shì)有害菌的初步鑒定結(jié)果Table 3 Preliminary identification of harmful bacteria in thawed pork

2.3 不同貯藏溫度下解凍豬肉有害菌再生長(zhǎng)

用不同的選擇性培養(yǎng)基，對(duì)不同貯藏溫度下解凍豬肉中有害菌的生長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行研究，結(jié)果如圖1所示。

圖1結(jié)果表明，在4℃條件下菌落總數(shù)及各種菌增長(zhǎng)都很快(圖1A)，從第4天起假單胞菌屬和熱死環(huán)絲菌數(shù)量顯著高于乳酸菌和腸桿菌科(P＜0.05)；菌落總數(shù)、假單胞菌屬和熱死環(huán)絲菌到第8天時(shí)對(duì)數(shù)值達(dá)到8.5 lg(CFU/g)左右；腸桿菌科后期增長(zhǎng)較快，對(duì)數(shù)值在7.5 lg(CFU/g)左右，高于乳酸菌(7.0 lg(CFU/g))，說(shuō)明假單胞菌屬、熱死環(huán)絲菌和腸桿菌科在4℃貯藏過(guò)程中再生長(zhǎng)占優(yōu)勢(shì)，這與傅鵬等[14]的研究結(jié)果一致。一般研究認(rèn)為菌落總數(shù)值達(dá)到107時(shí)肉的外觀有明顯的腐敗現(xiàn)象，達(dá)到108時(shí)外表有黏液形成，不宜加工或食用[12]。

0℃條件下的有害菌變化趨勢(shì)與4℃條件下類(lèi)似，但增長(zhǎng)較緩(圖1B)。從第0天起假單胞菌和熱死環(huán)絲菌數(shù)量已經(jīng)顯著高于其他菌(P＜0.05)，且在貯藏后期這兩種菌均有較明顯的增長(zhǎng)，其他菌基本趨于平衡。說(shuō)明假單胞菌屬和熱死環(huán)絲菌在低溫條件下易于生長(zhǎng)，是低溫條件下的優(yōu)勢(shì)有害菌，腸桿菌和乳酸菌受到一定的抑制，生長(zhǎng)速率明顯低于假單胞菌屬和熱死環(huán)絲菌，隨著溫度的降低，這種差異越明顯，這與Li等[15]的報(bào)道一致。

圖1 解凍豬肉在不同貯藏溫度下有害菌的再生長(zhǎng)Fig.1 Regrowth of harmful bacteria from thawed pork in various selective culture media at various temperatures

圖1 C所示的-5℃條件下菌落總數(shù)及其他菌均未見(jiàn)明顯增長(zhǎng)，甚至在貯藏初期還有所下降，最后趨于平衡，原因可能是凍結(jié)解凍的過(guò)程造成的溫度的波動(dòng)及低溫貯藏條件對(duì)各有害菌有損傷。結(jié)合圖1A和圖1B，進(jìn)一步表明假單胞菌屬和熱死環(huán)絲菌是解凍豬肉在低溫貯藏中再生長(zhǎng)速率較快的優(yōu)勢(shì)有害菌，這與大多數(shù)報(bào)道一致；雖然在0℃和-5℃條件下腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量較少，增長(zhǎng)緩慢，但是在4℃條件下增長(zhǎng)較快，也是有害的能導(dǎo)致腐敗的細(xì)菌之一；從乳酸菌的數(shù)量和增長(zhǎng)情況可以看出，乳酸菌不是優(yōu)勢(shì)的導(dǎo)致腐敗的有害菌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傅鵬等[14]、Russo等[16]的研究一致。

3 結(jié) 論

3.1 對(duì)解凍豬肉中初始有害菌的分析可知，假單胞菌屬、熱死環(huán)絲菌、腸桿菌科和乳酸菌是解凍豬肉中的初始有害菌。通過(guò)對(duì)不同的選擇性培養(yǎng)基上典型菌落進(jìn)行初步分離鑒定，得出假單胞菌屬、熱死環(huán)絲菌和腸桿菌科是解凍豬肉中的優(yōu)勢(shì)有害菌。

3.2 從解凍豬肉中不同貯藏溫度下菌落總數(shù)與各類(lèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)來(lái)看，假單胞菌屬與熱死環(huán)絲菌增長(zhǎng)最快，在4℃和0℃條件下均有不同程度的增長(zhǎng)，腸桿菌科在4℃條件下增長(zhǎng)也較快，乳酸菌數(shù)量最少，增長(zhǎng)很慢。肉類(lèi)工業(yè)應(yīng)采取相應(yīng)措施控制解凍豬肉中有害微生物的增長(zhǎng)。

[1]余小領(lǐng), 李學(xué)斌, 閆利萍, 等. 不同凍結(jié)和解凍速率對(duì)豬肉保水性和超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2007, 23(8): 261-265.

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Identification and Regrowth of Harmful Bacteria in Thawed Pork

LI Yuan-yuan，DONG Qing-li*，LIANG Na，HU Meng-han
(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

Pork that had been stored for 15 days at -18 ℃ was thawed to count harmful bacteria using different selective culture media, typical colonies growing on culture medium plates were separated and preliminarily identified, and an investigation into the regrowth of various harmful bacteria was carried out at 4, 0 or -5 ℃. It was found that the dominant harmful bacteria in thawed pork were Pseudomonas spp., Brochothrix thermosphacta, Enterbacteriaceae. Each harmful bacterium could grow at 4 or 0 ℃of storage temperature. Further studies showed that Pseudomonas spp. and Brochothrix thermosphacta grew faster than others, with more colony forming units (CFU) observed. While most of the harmful bacteria grew slower at -5 ℃, and even decreased to some extent.

thawed pork；harmful bacteria；regrowth

TS251.51；TS251.44；TS207.4

A

1002-6630(2011)04-0251-04

2010-05-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30800864)；上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教育科研專(zhuān)項(xiàng)(slg-07049)

黎園園(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品安全與質(zhì)量控制。E-mail：nishang1015@yahoo.com.cn

*通信作者：董慶利(1979—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品安全與質(zhì)量控制。E-mail：dongqingli@126.com