欒云峰，王 菲，劉長(zhǎng)江*，宗緒巖

軟棗獼猴桃總黃酮含量測(cè)定的方法研究

欒云峰，王 菲，劉長(zhǎng)江*，宗緒巖

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

選用ZrOCl2比色法、NaNO2-Al(NO3)3比色法、AlCl3比色法以及HPLC法測(cè)定軟棗獼猴桃總黃酮含量，通過(guò)對(duì)黃酮粗提液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與不同顯色劑反應(yīng)后進(jìn)行200～600nm波長(zhǎng)掃描，根據(jù)掃描結(jié)果確定各種反應(yīng)的適合波長(zhǎng)并進(jìn)行定量分析比較。結(jié)果表明，NaNO2-Al(NO3)3比色法與AlCl3比色法不適合軟棗獼猴桃總黃酮測(cè)定。在284nm波長(zhǎng)處，ZrOCl2比色法的線性方程Y=0.0114X-0.0001，R2=0.9991，平均加樣回收率為99.4%，RSD=1.61%(n=5)。ZrOCl2比色法是一種快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，適用于軟棗獼猴桃總黃酮含量測(cè)定。

軟棗獼猴桃；總黃酮；比色法

軟棗獼猴桃(Actinidia arguta Sieb.et Zucc.)，又名軟棗子，獼猴梨，藤瓜，屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)、獼猴桃屬(Actinidia)多年生落葉藤本植物[1-2]。果實(shí)可食用，多汁，酸甜適口，風(fēng)味獨(dú)特。營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，含大量VC、VB族維生素、氨基酸、類胡蘿卜素等多種營(yíng)養(yǎng)成分。

黃酮類化合物是一類植物中分布很廣而且重要的多酚類天然產(chǎn)物，泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)(A-與B-環(huán))通過(guò)中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物[3]。的生長(zhǎng)、發(fā)育、開(kāi)花、結(jié)果以及抵御異物的侵襲起著重要作用。黃酮化合物有具有廣泛的藥理活性，如抗菌作用、抗氧化作用和抗自由基作用[4]。

目前測(cè)定食品及中草藥中黃酮類的方法有直接測(cè)定法[5]、AlCl3法[6-8]、Al(NO3)3法[9-10]、紫外法[11]、HPLC[12-13]法等。有關(guān)食品及中草藥中黃酮類的含量測(cè)定，當(dāng)前用得較多的方法之一是以蘆丁為標(biāo)樣的NaNO2-Al(NO3)3顯色法，但是此反應(yīng)并不專一，很多非黃酮類物質(zhì)也可參與反應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響[14]。本實(shí)驗(yàn)以蘆丁為標(biāo)樣，通過(guò)分析研究，確定適合軟棗獼猴桃黃酮類測(cè)定的簡(jiǎn)便方法，為軟棗獼猴桃這一野生資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃 遼寧省本溪市。

蘆丁(rutin)、槲皮素(quercentin) 中國(guó)藥品生物制品鑒定所；甲醇(色譜純) Dikma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

600E-2487高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；Waters Nova-pak C1860A 4μm 3.9mm×150mm色譜柱；TU-180型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；移液器 德國(guó)Eppendorf公司；himac CR-21G高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；BP120S 電子天平 德國(guó)Sartorius公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 軟棗獼猴桃黃酮提取

取軟棗獼猴桃鮮果100g，勻漿，加入勻漿4倍體積70%(V/V)乙醇超聲處理，超聲功率300W，超聲時(shí)間25s，間隔10s，作用30次，超聲處理后60℃水浴2h，冷卻后4℃ 10000r/min離心15min，取上清液備用。1.3.2不同顯色反應(yīng)反應(yīng)液的紫外-可見(jiàn)光譜掃描

分別將不同顯色反應(yīng)的蘆丁及粗提樣品反應(yīng)液進(jìn)行200～600nm波長(zhǎng)掃描，以確定檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.3 粗提液中總黃酮含量的測(cè)定

ZrOCl2比色法[15]：取0.5mL黃酮粗提液置于比色管中，加入甲醇至5mL，再加入質(zhì)量濃度2g/mL ZrOCl2甲醇溶液1.5mL，以甲醇定容至10mL，靜置10min測(cè)定A284nm、A430nm。

AlCl3比色法[6-8]：取1mL黃酮粗提液置于比色管中，加入質(zhì)量濃度1.5g/100mL AlCl3-50%乙醇溶液8mL，以50%乙醇定容至25mL，靜置30min后測(cè)定A279nm、 A315nm。

NaNO2-Al(NO3)3比色法[9-10]：取1mL黃酮粗提液置于比色管中，加入30%乙醇至10mL，加入1mL質(zhì)量濃度5g/mL NaNO2溶液，搖勻，靜置6min，加入1mL質(zhì)量濃度10g/mL Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6min，加入5g/mL NaOH溶液10mL，以30%乙醇定容至25mL，靜置15min后測(cè)定A330nm、A510nm。

HPLC法[12-13]：流動(dòng)相：甲醇-水-1%磷酸梯度洗脫；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm；進(jìn)樣量：10μL。取黃酮粗提液20mL，加入3mol/L HCl溶液 3mL，80℃冷凝回流2h，冷卻，用堿中和，減壓蒸干，定容至5mL，取10μmL進(jìn)行HPLC測(cè)定。以槲皮素為外標(biāo)，計(jì)算粗提液中黃酮含量。

每種檢測(cè)方法均做4組平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

ZrOCl2比色法波長(zhǎng)掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。蘆丁在219、280、430nm有吸收峰，黃酮粗提液在273、284nm處有吸收峰。284nm處蘆丁與粗提物的吸收峰基本吻合，選擇為檢測(cè)波長(zhǎng)；在可見(jiàn)區(qū)蘆丁與黃酮粗提液的吸收峰不吻合，選擇蘆丁的吸收峰處430nm作為參考。

圖1 ZrOCl2顯色法在波長(zhǎng)200～600nm處的光譜掃描圖Fig.1 Ultraviolet scanning of flavonoid extracts and rutin for ZrOCl2colorimetric determination

圖2 AlCl3顯色法在波長(zhǎng)200～600nm處的光譜掃描圖Fig.2 Ultraviolet scanning of flavonoid extracts and rutin for AlCl3colorimetric determination

AlCl3比色法波長(zhǎng)掃描結(jié)果見(jiàn)圖2。蘆丁在210、273、415nm處有吸收峰，黃酮粗提液在233、279nm處有吸收峰。279nm處蘆丁與粗提物的吸收峰基本吻合，選擇為檢測(cè)波長(zhǎng)；在可見(jiàn)區(qū)蘆丁與黃酮粗提液的吸收峰不吻合，選擇蘆丁的吸收峰處415nm作為參考。

圖3 NaNO2-Al(NO3)3顯色法在波長(zhǎng)200～600nm處的光譜掃描圖Fig.3 Ultraviolet scanning of flavonoid extracts and rutin for NaNO2-Al(NO3)3colorimetric determination

由圖3可知，400～600nm范圍內(nèi)，蘆丁在504nm處有一不明顯的吸收峰，黃酮粗提液在492nm處有明顯的吸收峰；280～400nm范圍內(nèi)，蘆丁在367、352、340、330、320nm處有吸收峰，黃酮粗提液在339、363、330、287nm處有吸收峰；波長(zhǎng)小于280nm，蘆丁與黃酮粗提液吸收峰非常雜亂，并且吸收較弱。330nm處處蘆丁與粗提物的吸收峰基本吻合，選擇為檢測(cè)波長(zhǎng)；在可見(jiàn)區(qū)蘆丁與黃酮粗提液的吸收峰不吻合，選擇標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰處510nm作為參考。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

ZrOCl2比色法：分別取0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，按1.3.3節(jié)ZrOCl2比色法進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定A284nm、A430nm制作標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程：Y284=0.0114X-0.0001，R2=0.9991；Y430=0.008X＋0.0001，R2=0.9992。

AlCl3比色法：分別取0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.0、1.5、2、2.5mL，按1.3.3節(jié)AlCl3比色法進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定A279nm、A315nm制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為：Y279=0.0316X-0.0006，R2=0.9996；Y415=0.0315X-0.0002，R2=0.9999。

NaNO2-Al(NO3)3比色法：分別取0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.0、1.5、2、2.5mL，按1.3.3節(jié)NaNO2-Al(NO3)3比色法進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定A330nm、A492nm制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程：Y330=0.0196X＋0.0019，R2=0.9416；Y510=0.0727X＋0.0004，R2=0.9999。NaNO2-Al(NO3)3比色法在330nm處的吸收很不穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差，不適合進(jìn)行黃酮含量測(cè)定。

HPLC法：配制0.2mg/mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)，以峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：Y=2×10-7X＋0.1292，R2=0.9938。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖見(jiàn)圖4、5。

圖4 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜Fig.4 Chromatogram of quercetin standard

圖5 樣品HPLC圖譜Fig.5 Chromatogram of sample

2.3 不同檢測(cè)方法的比較

表1 不同顯色方法測(cè)定軟棗獼猴桃粗提液中總黃酮含量的比較Table 1 Comparison of total flavonoid contents in Actinidia arguta extract determined by different colorimetric methods

比色法測(cè)定的粗提液中總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)3種比色方法與HPLC法比較可知，ZrOCl2法在430nm處、AlCl3法在415nm處測(cè)得量明顯低于HPLC法，Al(NO3)3法在492nm處、AlCl3法在279nm處測(cè)得量明顯高于HPLC法，ZrOCl2法在284nm處測(cè)得量與HPLC法基本吻合。

NaNO2-Al(NO3)3法目前是在食品和中草藥測(cè)定黃酮類時(shí)，用的較多的方法之一，NaNO2-Al(NO3)3顯色法發(fā)生在黃酮分子B環(huán)的3＇,4＇-鄰二酚羥基部位，很多非黃酮類物質(zhì)如原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸、綠原酸、苯甲酸類、肉桂酸類及原花色素等多種物質(zhì)均具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)并在500nm左右有最大吸收或有較強(qiáng)吸收[12]，對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重影響。經(jīng)此方法測(cè)定的軟棗獼猴桃總黃酮含量明顯偏高，此方法不適用于測(cè)定軟棗獼猴桃總黃酮。黃酮分子B-環(huán)中存在游離的3-OH或5-OH時(shí)，均可與ZrOCl2形成黃色螯合物[3-4](圖6)，AlCl3能使黃酮化合物B-環(huán)的3-OH或5-OH與4-羰基形成比較穩(wěn)定的螯合物，這兩種化合物與黃酮的反應(yīng)均有較好的選擇性，但AlCl3法仍然不能很好的排除干擾，顯然ZrOCl2法更適合軟棗獼猴桃總黃酮的測(cè)定。

圖6 黃酮與ZrOCl2形成配合物的結(jié)構(gòu)Fig.6 Reaction mechanism between flavonoids and ZrOCl2

2.4 ZrOCl2比色法的方法評(píng)價(jià)

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0mL，樣品溶液0.4mL各5份，同1.3.3節(jié)中ZrOCl2比色法操作，測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品吸光度的RSD=0.71%(n=5)，樣品吸光度的RSD=1.07%(n=5)，說(shuō)明精密度良好。精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision experiments

2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0mL，樣品溶液0.4mL，同1.3.3節(jié)ZrOCl2比色法操作在0、10、20、30、45、60、90、120min測(cè)定其吸光度。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品在120min內(nèi)穩(wěn)定，樣品在60min內(nèi)基本穩(wěn)定。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of stability experiments

2.4.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

分別取已知濃度的粗提液1mL與5個(gè)比色管中，向每個(gè)比色管中加入一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3節(jié)中ZrOCl2比色法測(cè)定含量并計(jì)算加標(biāo)回收率。

表4 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of recovery rate experiments

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)黃酮粗提液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與不同顯反應(yīng)后進(jìn)行200～600nm波長(zhǎng)掃描結(jié)果分析，確定各種顯色反應(yīng)的適合波長(zhǎng)，并以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品峰值作為參考值。將NaNO2-Al(NO3)3法、ZrOCl2法、AlCl3法定量分析結(jié)果與HPLC測(cè)定結(jié)果比較，其中ZrOCl2法測(cè)定結(jié)果與HPLC測(cè)定結(jié)果基本一致。通過(guò)比較分析，得到了ZrOCl2比色法(測(cè)定波長(zhǎng)為284nm)與HPLC法之間的校正系數(shù)為0.89。HPLC法雖然可以較準(zhǔn)確地測(cè)定總黃酮含量，但對(duì)設(shè)備和操作要求較高，計(jì)算繁瑣。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品的ZrOCl2比色法是一種操作簡(jiǎn)便、結(jié)果較準(zhǔn)確的方法，可用于軟棗獼猴桃總黃酮類含量的快速測(cè)定。

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A Comparative Study of Different Methods for the Determination of Total Flavonids in Actinidia arguta

LUAN Yun-feng，WANG Fei，LIU Chang-jiang*，ZONG Xu-yan
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Total flavonoids in Actinidia arguta were determined separately by ZrOCl2 colorimetry, NaNO2-Al(NO3)3 colorimetry, AlCl3colorimetry and HPLC. Wavelength scanning of flavonoid extracts and rutin after reaction with different chromogenic reagents was performed in a range of 200-600 nm. Results showed that NaNO2-Al(NO3)3colorimetry and AlCl3colorimetry were fount not suitable for the determination of total flavonoids in Actinidia arguta. An excellent linear equation for ZrOCl2 colorimetric determination at 284 nm wavelength was obtained as follows: Y284 = 0.0114X-0.0001, R2= 0.9991. The average recovery rate was 99.4% with a RSD of 1.61% (n = 5). ZrOCl2colorimetry is a quick accurate method for the determination of total flavonoids in Actinidia arguta.

Actinidia arguta；total flavonoids；colorimetry

S663.4

A

1002-6630(2011)04-0155-04

2010-03-20

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(200903013)

欒云峰(1986—)，男，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：fluyuan@126.com

* 通信作者：劉長(zhǎng)江(1955 —)，男，教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：liucj597@sohu.cm