梅雪嶺，連 石

? 論 著 ?

p53蛋白在UVB誘導凋亡的富集表皮干細胞的角質(zhì)形成細胞中的表達

梅雪嶺，連 石

目的 研究p53蛋白在中波紫外線(ultraviolet light B，UVB)誘導凋亡的富集表皮干細胞的角質(zhì)形成細胞群中的表達情況。方法 分離富集人表皮干細胞的角質(zhì)形成細胞群和正常角質(zhì)形成細胞群，使用UVB誘導兩種細胞群凋亡，蛋白印跡法比較不同劑量UVB誘導前后兩組細胞的p53蛋白表達的差異。結(jié)果 兩種細胞在不同劑量的UVB照射后p53蛋白表達均比照射前顯著增加，在20mJ/cm2與40mJ/cm2照射劑量時，富集人表皮干細胞的角質(zhì)形成細胞群p53蛋白表達高于正常角質(zhì)形成的細胞群，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 富集人表皮干細胞的角質(zhì)形成細胞p53蛋白表達比其它角質(zhì)形成細胞對中波紫外線的照射易感。

p53蛋白；干細胞；凋亡；皮膚癌

人類表皮干細胞于1970年被發(fā)現(xiàn)，其主要的生物學功能是維持表皮的自然更替和創(chuàng)傷后的愈合[1]。表皮干細胞的研究前景廣闊，目前利用表皮干細胞體外擴增制備的人工表皮已經(jīng)用于臨床燒傷的治療。探討表皮干細胞與皮膚癌的關系是研究的另一備受關注的方向，人們希望這是探尋皮膚癌防治的一條道路[2]。前期研究表明，表皮干細胞的凋亡與皮膚癌之間存在一定聯(lián)系[3]。有研究顯示p53蛋白通過調(diào)控細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導途徑而參與了調(diào)控細胞的凋亡反應，是細胞凋亡反應中的關鍵蛋白[4,5]。同時p53蛋白還是一種抑癌因子，50%皮膚鱗狀細胞癌存在p53蛋白基因的突變[6]。目前關于p53蛋白在表皮干細胞凋亡過程中的表達情況尚未有研究[7-9]。因此我們研究窄譜中波紫外線（UVB）誘導下的表皮干細胞的凋亡反應中p53蛋白的表達情況并分析其表達特征與表皮干細胞凋亡反應的關系。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

正常人皮膚標本來源于包皮環(huán)切術的患者（年齡≤20歲）（標本使用經(jīng)本院倫理委員會批準）。中性蛋白酶II（2.4 U/ ml；羅氏，德國），胰蛋白酶/EDTA （Cascade Biologics，美國），蛋白酶抑制劑（Cascade

1.2 方法

1.2.1 富集人表皮干細胞的角質(zhì)形成細胞群以及正常原代角質(zhì)形成細胞的分離和培養(yǎng) 依據(jù)傳統(tǒng)制備原代角質(zhì)形成細胞的方法分離人原代角質(zhì)形成細胞群[3]，將皮膚標本置于中性蛋白酶II中，4℃過夜使表皮與真皮分離。將表皮片置于胰蛋白酶/EDTA中，37℃作用30 min，以蛋白酶抑制劑終止反應，加入EpiLife培養(yǎng)基制備成人正常原代角質(zhì)形成細胞的單細胞懸液。將單細胞懸液種于培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)正常原代角質(zhì)形成細胞（normal primary keratinocytes，KC）。利用快速粘附IV型膠原法制備富集人表皮干細胞的角質(zhì)形成細胞（keratinocytes adherent to collagen type IV，AC）[3]。即將人的原代角質(zhì)形成細胞的單細胞懸液種于用20 μg/ml IV型膠原包被的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。之后，用培養(yǎng)基清洗培養(yǎng)板2次，將培養(yǎng)板內(nèi)沒有粘附的細胞全部去掉，剩余的即為快速粘附IV型膠原的角質(zhì)形成細胞。將兩種細胞群置于相同的條件下培養(yǎng)，EpiLife培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24h后進行UVB照射。

1.2.2 UVB照射 用磷酸緩沖液清洗所培養(yǎng)的細胞兩次，細胞表面只保留少量磷酸緩沖液。用UVB （UV236B Waldmann，德國，波長285～320 nm，峰值312 nm）于25℃室溫下照射細胞。輻射能量分為0、20、40和80 mJ/cm2。將照射后的細胞置于無生長因子的EpiLife培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8h后，用于實驗。

1.2.3 蛋白印跡 將細胞置于混有蛋白酶抑制劑的裂解液中裂解15 min。按照蛋白定量試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度。每孔內(nèi)加入相等量的蛋白并通過15% SDS-PAGE凝膠在60mA毫安下電泳90 min。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。加一抗鼠抗人p53單克隆抗體4℃過夜，加二抗抗鼠HRP抗體室溫作用 1h。使用ECL化學發(fā)光顯色液顯色照相并用凝膠成像掃描系統(tǒng)分析熒光強度。熒光強度值即代表蛋白樣品的相對含量，取其與Actin的光密度比值進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

接受不同劑量（0，20, 40, 80 mJ/cm2）UVB照射后8小時，兩種細胞群的p53蛋白表達電泳見圖1。兩種細胞在20、40、80 mJ/cm2的UVB照射后，p53蛋白表達均比照射前（0 mJ/cm2）顯著增加（P＜0.05）；KC接受照射后p53 蛋白表達隨劑量增加而相應上升，而AC p53蛋白表達的峰值出現(xiàn)在40mJ/cm2劑量時，之后略有下降。兩種細胞在0、20、40、80mJ/cm2照射劑量下，p53蛋白的光密度比值分別為AC：0.038 ±0.021、0.826 ±0.031、0.912±0.037、0.719±0.028；KC：0.008 ±0.020、0.326 ±0.030、0.701 ±0.022、0.812±0.032。其中20mJ/cm2與40mJ/cm2劑量照射后，AC細胞p53蛋白表達均高于KC，差異均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（圖2）。

3 討論

表皮是位于真皮外層的復層上皮，表皮的終末分化細胞不斷脫落，并依賴其具有自我更新和產(chǎn)生子代細胞能力的干細胞替代。研究顯示，正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘毎枰?～5個遺傳事件，對于表皮細胞而言最具有積累損傷而形成癌細胞的可能性。因此，研究人員普遍認為表皮干細胞是致癌因素作用的靶細胞，也很可能是腫瘤基因治療的靶點[2]。在之前的研究中，我們利用UVB誘導富集表皮干細胞的角質(zhì)形成細胞的凋亡反應，發(fā)現(xiàn)UVB照射后表皮干細胞較其它角質(zhì)形成細胞更易于凋亡。由于凋亡現(xiàn)象能夠去除一部分DNA異常的細胞，因此研究結(jié)果提示我們表皮干細胞的一些生物學特性可能是人體防御皮膚癌的天然屏障，而此屏障的異?；蛟S是皮膚癌發(fā)生的原因之一[3]。本研究中，我們繼續(xù)深入研究之前的實驗，檢測UVB誘導的凋亡的表皮干細胞的p53蛋白的表達。利用快速粘附細胞外基質(zhì)蛋白的方法分離富集人表皮干細胞的角質(zhì)形成細胞群，同時制備正常人的原代角質(zhì)形成細胞群，UVB誘導兩種細胞群凋亡[3]，檢測兩種細胞群p53蛋白的表達情況。

圖1 不同劑量UVB 照射后AC和KC細胞p53蛋白電泳圖

圖2 不同劑量UVB 照射后AC和KC細胞p53蛋白表達量化圖

研究發(fā)現(xiàn)，UVB照射后，正常角質(zhì)形成細胞的p53蛋白的表達隨照射劑量增加而逐漸升高，各照射組蛋白表達均顯著高于未照射組，說明UVB能夠顯著刺激角質(zhì)形成細胞p53蛋白的表達，且呈劑量依賴趨勢。同時，UVB照射后富集表皮干細胞的角質(zhì)形成細胞的p53表達亦顯著增加，各照射劑量組細胞p53蛋白的表達均顯著高于未照射組，40mJ/cm2照射劑量時為蛋白表達的峰值，80mJ/cm2照射劑量時蛋白表達則略低于40mJ/cm2組，說明UVB雖然能夠顯著刺激表皮干細胞中p53蛋白的增加，但高劑量的UVB卻在一定程度上抑制了p53蛋白的表達。此外，研究結(jié)果還顯示，20 mJ/cm2和40 mJ/cm2UVB照射后富集人表皮干細胞的角質(zhì)形成細胞p53蛋白的表達顯著高于正常角質(zhì)形成細胞的p53蛋白表達，說明在20 mJ/cm2和40 mJ/cm2UVB照射劑量作用下，表皮干細胞中p53蛋白的活化表達強于其它角質(zhì)形成細胞，即表皮干細胞內(nèi)的p53蛋白對UVB較易感。之前的實驗顯示UVB照射后富集人表皮干細胞的角質(zhì)形成細胞表現(xiàn)為凋亡易感，因此我們推斷p53蛋白在表皮干細胞的凋亡易感性中可能發(fā)揮了重要作用。此結(jié)果不僅再次證實了p53蛋白在表皮細胞凋亡中的關鍵作用，更進一步深入闡明了表皮干細胞的生物學特性。另外我們還發(fā)現(xiàn)在80 mJ/cm2UVB劑量照射后富集人表皮干細胞的角質(zhì)形成細胞p53蛋白的表達與正常角質(zhì)形成細胞的p53蛋白表達沒有顯著差異，說明表皮干細胞中的p53蛋白對低劑量的UVB較敏感。我們推測其可能的原因是：UVB照射后，雖然表皮干細胞內(nèi)的多種蛋白活化并參與了凋亡反應如p53，bcl-2，Bax等[10]，但不同的蛋白可能對不同劑量的UVB敏感性不同，因此導致了細胞凋亡反應的差別。我們也將繼續(xù)研究UVB誘導的表皮干細胞凋亡反應中其它相關蛋白的表達情況，從而更加了解表皮干細胞的生物學特性。

綜上所述，本研究證實了p53蛋白在UVB誘導的凋亡的表皮干細胞中的活化，并且我們發(fā)現(xiàn)在低劑量的UVB誘導下，表皮干細胞的p53蛋白比其它角質(zhì)形成細胞的p53蛋白更易活化。其結(jié)果為皮膚癌的成因與防治研究拓展了一條新思路。

[1] Watt FM, Jensen KB. Epidermal stem cell diversity and quiescence [J]. EMBO Mol Med, 2009, 1(5):260-267.

[2] Finlan LE, Hupp TR. Epidermal stem cells and cancer stem cells: insights into cancer and potential therapeutic strategies [J]. Eur J Cancer, 2006, 42(9):1283-1292.

[3] Mei XL, Lian S. Ultraviolet B light-induced apoptosis in human keratinocytes enriched with epidermal stem cells and normal keratinocytes [J]. Chin Med J(Engl), 2011, 124(4):591-598.

[4] Chaturvedi V, Qin JZ, Stennett L, et al. Resistance to UV-induced apoptosis in human keratinocytes during accelerated senescence is associated with functional inactivation of p53 [J]. J Cell Physiol, 2004, 198(1):100-109.

[5] Verschooten L, Declercq L, Garmyn M. Adaptive response of the skin to UVB damage: role of the p53 protein [J]. Int J Cosmet Sci, 2006, 28(1):1-7.

[6] Raj D, Brash DE, Grossman D. Keratinocyte apoptosis in epidermal development and disease [J]. J Invest Dermatol, 2006, 126(2):243-257.

[7] Van Laethem A, Garmyn M, Agostinis P. Starting and propagating apoptotic signals in UVB irradiated keratinocytes [J]. Photochem Photobiol Sci, 2009, 8(3):299-308.

[8] Latonen L, Laiho M. Cellular UV damage responses--functions of tumor suppressor p53 [J].Biochim Biophys Acta, 2005, 1755(2):71-89.

[9] Papoutsaki M, Moretti F, Lanza M, et al. A p38-dependent pathway regulates DeltaNp63 DNA binding to p53-dependent promoters in UV-induced apoptosis of keratinocytes [J]. Oncogene, 2005, 24(46):6970-6975.

[10] Decraene D, Agostinis P, Pupe A, et al.Acute response of human skin to solar radiation: regulation and function of the p53 protein [J]. J Photochem. Photobiol, 2001, 63 (1):78-83.

p53 expression in UVB-induced apoptotic human keratinocytes enriched with epidermal stem cells

MEI Xue-ling，LIAN Shi
Department of Dermatology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100052, China

Objective To investigate p53 expression in ultraviolet light B(UVB)-induced apoptotic human keratinocytes enriched with epidermal stem cells. Methods Keratinocytes enriched with epidermal stem cells and normal primary keratinocytes were isolated and induced apoptosis by UVB. The expression of p53 was investigated by Western blotting. Results UVB irradiation increased p53 expression of cells. Compared to normal primary keratinocytes, p53 expression of keratinocytes enriched with epidermal stem cells significantly increased at 20 and 40 mJ/cm2(P＜0.05). Conclusion p53 expression of human epidermal stem cells are more susceptible than other keratinocytes.

p53 protein；Stem cells；Apoptosis；Skin Neoplasms [J Pract Dermatol, 2011, 4(4):197-199]

R318

A

1674-1293(2011)04-00197-03

梅雪嶺

100052，首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院皮膚科（梅雪嶺）；首都醫(yī)科大學北京宣武醫(yī)院皮膚科（連石）

梅雪嶺，博士，主治醫(yī)師，研究方向: 皮膚病理與表皮干細胞研究，E-mail: dayoff@vip.sina.comBiologics，美國），EpiLife培養(yǎng)基（Cascade Biologics，美國），蛋白定量試劑盒（Bio-Rad Hercules，美國），鼠抗人p53單克隆抗體（Santa Cruz，美國）。

2011-09-14

2011-11-06）（本文編輯 祝賀）