王曉婷 ，張志清 ，王曉紅 ，張 靜 ，孫利麗 ，汪怡新 ，王蘇平

(1. 大連市友誼醫(yī)院 老年病科，遼寧 大連 116001； 2. 大連市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116033)

一氧化碳(carbon monoxide, CO)是生活和生產(chǎn)中造成中毒性死亡最常見的窒息性氣體，其中毒和死亡人數(shù)在中國各種急性中毒疾病中高居首位。CO可以引起機體多個系統(tǒng)損傷，其中大腦損害最為嚴重。雖然對CO中毒的研究已相當?shù)纳钊隱1-4]，但對其機制，尤其是內(nèi)皮系統(tǒng)所發(fā)揮的作用，認識尚不完全清楚。因此，進一步加深對急性CO中毒的內(nèi)皮系統(tǒng)動態(tài)機制研究，對臨床防治CO 中毒、減少死亡率、預(yù)防一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病 (delayed encephalopathy after carbon monoxide poisoning, DEACMP)的發(fā)生均具有重要的意義。

促血管生成素家族(Angiopoietins, Ang)與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) 同屬于血管生長因子，共同參與新血管形成[5]。促血管生成素家族中的Ang-1(Angiopoietin-1)和Ang-2(Angiopoietin-2)均能識別受體酪氨酸激酶Tie-2(tyrosine kinase receptor, Tie-2)，但其效應(yīng)不同，對血管生成具有雙向調(diào)節(jié)作用[6-7]。

本實驗在建立的CO中毒小鼠模型上，應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)，在mRNA水平動態(tài)觀察小鼠海馬區(qū)Ang-1、Ang-2和Tie-2表達的變化規(guī)律，探討CO中毒對小鼠腦內(nèi)血管內(nèi)皮系統(tǒng)的影響，為臨床上CO中毒的治療和防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

雄性昆明系小鼠，6～8周齡，96只，隨機分成兩組(空氣對照組和CO組)，每組48只?？諝鈱φ战M(簡稱對照組)小鼠等量空氣腹腔注射；CO組小鼠單次腹腔注射99.9%的CO氣體，劑量為170 mL/kg。各在6 h、1 d、2 d、3 d、4 d、7 d、14 d、28 d取小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)組織(每個時間點6只小鼠)，所有標本均于30 min 內(nèi)取材，并立刻置于- 70 ℃低溫冰箱保存待用。

1.2 試劑與儀器

99.9%CO氣體購自大連特種氣體公司，Trizol 采用Invitrogen 公司的產(chǎn)品，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購于Promega 公司，DMEM細胞培養(yǎng)液購于Intrivigon公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成，PCR 試劑盒購自TaKaRa公司。PCR 儀為Thermo Hybaid PxE 型PCR 儀， 紫外分光光度計為DU800 A型，凝膠成像分析系統(tǒng)為labworker 4.6。

1.3 方 法

1.3.1 總RNA的提?。悍謩e稱量小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)組織，并以mg/mL加入相應(yīng)的DMEM細胞培養(yǎng)液研磨，RNA 的提取嚴格按照Trizol 說明書進行，抽提后的RNA使用分光光度計測量濃度，并以A260/A280的比值鑒定RNA樣本純度。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA：RNA樣本加入DEPC水調(diào)整總RNA濃度，使其一致，然后進行逆轉(zhuǎn)錄。cDNA 合成反應(yīng)條件：冰上于0.5 mL EP 管中加入總RNA 2 μL ，引物Oligo(dT) (0.5 mg/ L) 1 μL ，DEPC水12 μL ，混勻短暫離心后置70 ℃ 5 min，冰上1 min ；順序加入5×buffer 5 μL ，20 U/μL核糖核酸酶抑制劑1 μL ，10 mmol/ L dNTP 3 μL ，混勻短暫離心后置37 ℃ 5 min ，冰上1 min ，加入M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL后將混合物置42 ℃ 60 min ，70 ℃ 10 min 中止反應(yīng)后置冰上。

1.3.3 PCR的擴增及產(chǎn)物的圖像分析：PCR 采用25 μL反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，dNTP 2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/ L MgCl21.5 μL ，Taq 酶(2.5 U/μL ) 1 μL ，雙蒸水15 μL 。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 20 s，退火溫度(Ang-1為56 ℃，Ang-2為56 ℃，Tie-2為54 ℃，β-actin為55.5 ℃) 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min 。取5 μL 產(chǎn)物加1 μL 6×上樣緩沖液置1 %瓊脂糖凝膠中電泳，電壓120 V，30 min 后置于全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)上分析，計算所得產(chǎn)物的積分吸光度與各自內(nèi)參β-actin積分吸光度的比值，以反映該mRNA 的相對表達水平。引物序列見表 1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 CO中毒后Ang-1、Ang-2和Tie-2 mRNA的表達

RT-PCR結(jié)果顯示：與空氣對照組相比，CO中毒后，Ang-1、Ang-2和Tie-2 mRNA表達隨時間增加(P<0.05)，中毒后第3天達到第1個高峰(7.02±0.11，7.67±0.22和8.73±0.07，P<0.05)，第4天Ang-1、Ang-2和Tie-2 mRNA表達下降，并于第7天，Ang-1、Ang-2和Tie-2 mRNA表達達到第2個高峰(6.60±0.36，7.99±0.06和7.69±0.05，P<0.05)，第28天表達水平恢復(fù)正常。Ang/Tie-2系統(tǒng)表達呈規(guī)律性變化，見圖1～3。

圖1 空氣對照組與CO組Ang-1 mRNA相對表達結(jié)果比較

圖2 空氣對照組與CO組Ang-2 mRNA相對表達結(jié)果比較

圖3 空氣對照組與CO組Tie-2 mRNA相對表達結(jié)果比較

2.2 Ang-2/Ang-1比值的變化

空氣對照組Ang-2/Ang-1的比值在6 h ～ 28 d內(nèi)保持比較低的水平，比值恒定(0.36±0.03)；CO組的Ang-2/Ang-1比值在6 h即升高達到高峰(1.55±0.07，與對照組比較差異有顯著性意義，P<0.05)；于第2天到達低谷，隨后比值緩慢上升于第7天達到第2個高峰(1.24±0.10，與對照組比較差異有顯著性意義，P<0.05)，第14天時與對照組比較，差異無顯著性意義，見圖 4。

圖4 空氣對照組與CO組Ang-2/Ang-1的比值變化

3 討 論

急性CO中毒性腦病發(fā)病機制一直是國內(nèi)外研究的熱點問題，雖然已經(jīng)取得很大進展，但到目前為止，其發(fā)病機制仍不清楚[8]。

在新生血管生成過程中，已知有20種生長因子參與血管生成的調(diào)控過程，其中特異性作用于內(nèi)皮細胞的血管生成素家族中的Ang-1和Ang-2與血管生成密切相關(guān)，他們與內(nèi)皮細胞表面特異受體Tie-2酪氨酸激酶結(jié)合發(fā)揮促血管生成作用[9]。Ang-1能保持血管內(nèi)皮的穩(wěn)定性，促使血管成熟；Ang-2是Ang-1內(nèi)源性拮抗劑，破壞血管的穩(wěn)態(tài)，與內(nèi)皮細胞的增殖有關(guān)。因此，Ang-2觸發(fā)血管新生的發(fā)生，但新生的血管結(jié)構(gòu)不完整，需要Ang-1去加固穩(wěn)定，才能形成正常的血管形態(tài)。所以，Ang-2主要在血管新生的早期起作用，Ang-1在血管新生中后階段起效。Ang/Tie-2系統(tǒng)參與血管新生的最后階段，通過干預(yù)內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和周細胞的相互作用促進血管生成和重塑，在缺血等病理狀態(tài)下可作為一種關(guān)鍵的血管生成調(diào)節(jié)劑。

本研究結(jié)果顯示，CO中毒后，Ang-1、Ang-2和Tie-2 mRNA表達在6 h開始升高，于第3天達到第1個高峰，這可能是由于CO中毒后，小鼠腦部海馬區(qū)迅速缺氧，血管損傷，內(nèi)皮細胞出現(xiàn)死亡，這個過程是逐漸加重的。為了改善腦缺氧缺血狀態(tài)，建立有效的側(cè)支循環(huán)，Ang/Tie-2系統(tǒng)代償性出現(xiàn)表達上調(diào)，并與其他血管特異性因子共同參與新生血管形成；第4天Ang-1、Ang-2和Tie-2 mRNA表達下降，說明損傷區(qū)的血管在Ang/Tie-2系統(tǒng)作用下得到重建和修復(fù)，但是腦缺氧缺血所造成的腦損傷仍持續(xù)存在，所以Ang/Tie-2系統(tǒng)的表達仍高于正常水平；第7天，Ang-1、Ang-2和Tie-2 mRNA水平達到第二個高峰。第二次表達上調(diào)的具體原因和機制尚不清楚，可能與CO中毒后腦組織急性缺氧，造成持續(xù)的細胞毒性和血管源性腦水腫而導(dǎo)致的DEACMP的發(fā)生有關(guān)。Ang/Tie-2系統(tǒng)再次出現(xiàn)代償性增高，降低血管通透性，減輕腦水腫，拮抗內(nèi)皮細胞凋亡，誘導(dǎo)新生血管形成。此后Ang/Tie-2系統(tǒng)表達下降，損傷區(qū)的血管逐漸重建和修復(fù)，于第28天Ang/Tie-2系統(tǒng)達到正常水平，血管的重建和修復(fù)恢復(fù)到正常水平。

Ang-2/Ang-1比值的結(jié)果顯示，在6 h之前，2～7 d這兩個階段呈現(xiàn)上升趨勢，在6 h～2 d、7～14 d這兩個階段呈現(xiàn)下降趨勢。說明CO中毒后，在6 h之前，2～7 d這兩個階段Ang-2的表達增長值高于Ang-1，這期間Ang-2的作用應(yīng)該占主導(dǎo)地位，主要是拮抗Ang-1/Tie-2的功能，破壞血管穩(wěn)定性，參與血管內(nèi)皮的增殖，有利于新生血管的形成和重構(gòu)；而6 h～2 d、7～14 d這兩個階段Ang-1的表達增長值高于Ang-2，這期間Ang-1的作用應(yīng)該占主導(dǎo)地位，通過和磷酸化Tie-2的結(jié)合，產(chǎn)生抗凋亡作用，增強細胞存活能力，并通過一系列的細胞信號傳導(dǎo)途徑，促使形成完整的血管壁。這種表達的差異性有利于新生血管的成熟。

另外，本實驗結(jié)果與作者以前曾經(jīng)應(yīng)用HE染色計數(shù)微血管數(shù)的實驗結(jié)果基本相符(圖 5)。由圖5可見，CO組3 d和7 d微血管數(shù)較對照組明顯增多(對照組各時間點無明顯變化)，其結(jié)果與Ang-1和Ang-2的表達變化基本一致，說明Ang-1和Ang-2的表達參與了血管新生的過程。

圖5 空氣對照組與CO組微血管計數(shù)結(jié)果比較(HE 染色)

綜上所述，CO中毒后小鼠腦內(nèi)血管內(nèi)皮Ang/Tie-2系統(tǒng)隨著腦部損傷的程度不同發(fā)生規(guī)律性變化，發(fā)揮著血管重建和修復(fù)作用。目前，圍繞Ang/Tie-2系統(tǒng)還有許多問題尚待闡明，如Ang的核定位信號如何引導(dǎo)Ang入核，以及其入核后又是如何與相關(guān)基因和蛋白質(zhì)作用而起到促血管生成作用的。這些問題的徹底闡明將有助于今后更深刻地了解Ang促血管生成的機制，進而更好地理解CO中毒后血管重建和修復(fù)的機制。本研究在分子水平初步說明了Ang/Tie-2系統(tǒng)在腦缺氧后發(fā)揮的重要作用，為以后的實驗研究提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，也為進一步探討CO中毒和DEACMP的病理機制和預(yù)防治療提供了相關(guān)的理論依據(jù)。

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