何順亮，司 敏，周海華，余文娟，宋瑞祥，施廣霞，郭連英，郝 冰

(大連醫(yī)科大學(xué) 1.臨床醫(yī)學(xué)七年制2006級(jí)，2.臨床醫(yī)學(xué)2007級(jí)，3.病理生理教研室，遼寧 大連 116044)

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是首先由Sen、Baltimore、Mercurio等,在1986年從成熟B 淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞核的抽提物中發(fā)現(xiàn)的核蛋白因子,因能與免疫球蛋白的κ輕鏈基因內(nèi)含增強(qiáng)子的特異性序列(即κB序列,10bP : 5’-GGGACTTTCC-3’)特異結(jié)合并促進(jìn)κ鏈基因表達(dá)而被稱為核因子κB ( nuclear factor - κB,NF -κB)[1，2]，該因子是一個(gè)由復(fù)雜的多肽亞單位組成的蛋白家族,包括Rel ( c - Rel) ,RelA(p65) ,RelB,NF -κB1 (p50)和NF -κB2 (p52、p49、p50B)。NF -κB是真核生物中廣泛存在的一種多向性、多功能的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖的相關(guān)基因,在細(xì)胞癌變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽 (Pyrro1idine dithiocarbamate ,PDTC) 是NF-κB的特異性抑制劑，PDTC可抑制淋巴瘤、乳腺癌和卵巢癌等腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制促炎性因子的分泌[3-5]。本實(shí)驗(yàn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)研究PDTC 對(duì)小鼠腹水型肝癌Hca-F的抗腫瘤作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng) 物

Balb/c小鼠，無(wú)特定病原體， 雌雄各半，共20只，體重雌鼠18～32 g，雄鼠27～39 g。

1.2 藥品、試劑與器材

PDTC購(gòu)于sigma公司； MTT購(gòu)于Amresco公司，生產(chǎn)批號(hào)：0793；DMSO購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，生產(chǎn)批號(hào)：060831，丙二醛(Maleic Dialdehyde MDA)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。低溫高速離心機(jī)(EVOLUTION TMKC，美國(guó))，酶標(biāo)儀(BIO-RADmodel550，日本)。

1.3 腫瘤細(xì)胞株

小鼠Hca-F細(xì)胞株為源自小鼠肝癌細(xì)胞H22的高淋巴道轉(zhuǎn)移亞系，常規(guī)傳代保種。

1.4 體外實(shí)驗(yàn)

1.4.1 實(shí)驗(yàn)方法[6]：(1) 標(biāo)本處理：無(wú)菌條件下取小鼠腹水0.1 mL加于預(yù)盛有PBS緩沖液3 mL的離心管中，離心棄上清，用PBS緩沖液2 mL沖洗后離心3遍，加含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(1640全培基，下同)吹打成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)濃度至1×106細(xì)胞/mL。(2)細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中(200 μL /孔)，設(shè)空白對(duì)照組(1640全培基)、細(xì)胞對(duì)照組(腫瘤細(xì)胞+1640全培基)、實(shí)驗(yàn)組(腫瘤細(xì)胞+含PDTC全培基)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照孔不加藥物。PDTC 用藥組分別加入4種不同的濃度的PDTC，從低到高依次為12.5 μg/mL、 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL。37℃,5%CO2下培養(yǎng)培養(yǎng)24 h或8 h，每孔加入20 μL 5%MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心去上清，加入DMSO 150 μL/孔，于微量振蕩器上振蕩10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解，最后放入酶標(biāo)儀上以570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值(absorbance,A)。重復(fù)3遍。

1.4.2 計(jì)算抑制率：按照實(shí)體瘤體外敏感標(biāo)準(zhǔn)[7]，抑制率>30%為敏感，<30%為耐藥。以抑制率≥70% 為體外高度敏感，50% ≤抑制率<70% 為中度敏感，30% ≤ 抑制率<50%為低度敏感。抑制率=[(細(xì)胞對(duì)照組平均A值-實(shí)驗(yàn)組平均A值)/(細(xì)胞對(duì)照組平均A值-空白對(duì)照組平均A值)]×100% 。

1.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

(1)動(dòng)物分組：20只小鼠，雌雄各半，每只鼠右側(cè)腋下皮下接種Hca-F癌細(xì)胞1×106/0.2 mL·只，隨機(jī)分為攻擊對(duì)照組、PDTC治療組。(2)給藥方法：PDTC治療組腹腔注射0.25 g/mL PDTC溶液0.2 mL，攻擊對(duì)照組腹腔注射生理鹽水 0.1 mL/25 g。(3)指標(biāo)觀察：給藥后每日測(cè)量腫瘤體積和體重，用藥結(jié)束后處死小鼠后取小鼠的腫瘤并記錄體重和瘤重。(4)去除腫瘤中的脂肪和纖維組織，采取10倍稀釋制備腫瘤組織勻漿，按照丙二醛(malondialchehyche，MDA)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定MDA含量，采用放射免疫法檢測(cè)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 PDTC對(duì)肝癌細(xì)胞的體外增殖影響

用含有PDTC的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)Hca-F細(xì)胞24 h或8 h后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果顯示PDTC對(duì)Hca-F細(xì)胞的增殖有抑制作用，濃度為25 μg/mL對(duì)Hca-F細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)， PDTC濃度作用曲線見(jiàn)圖1。

2.2 PDTC治療對(duì)小鼠腫瘤體積和瘤重的影響

PDTC治療接種腫瘤的小鼠10 d，每天測(cè)量腫瘤體積，活殺小鼠測(cè)瘤重，結(jié)果表明PDTC對(duì)腫瘤生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的抑制作用，與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性意義，結(jié)果見(jiàn)圖2和3。

圖1 PDTC 對(duì)Hca-F細(xì)胞增殖的抑制作用

圖2 PDTC治療后Hca-F瘤體積的變化

圖3 PDTC治療后Hca-F瘤重的變化

2.3 MDA檢測(cè)結(jié)果

取小鼠腫瘤組織進(jìn)行MDA試劑盒檢測(cè)，PDTC組小鼠腫瘤組織勻漿MDA含量為(0.041889±0.00219)μmol/g，攻擊對(duì)照組為(0.039111±0.00388)μmol/g，兩組之間的差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。

2.4 TNF-α放射免疫檢測(cè)結(jié)果

注射PDTC組的小鼠腫瘤組織勻漿中TNF-α的含量(1.809±2.315) ng/mL低于生理鹽水的小鼠腫瘤組織(2.233±2.561)ng/mL，但兩組間比較，差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。

3 討 論

一些體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究表明,抑制腫瘤細(xì)胞NF-κB的活性將引起腫瘤細(xì)胞的凋亡,從而抑制腫瘤的生長(zhǎng),增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療和化療的敏感性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。作為NF-κB的抑制劑PDTC如能應(yīng)用于臨床的腫瘤治療，則能減少化療藥物的嚴(yán)重毒副作用和化療耐藥的發(fā)生率,延長(zhǎng)化療耐藥產(chǎn)生時(shí)間從而進(jìn)一步提高化療效果[9,10]。而本實(shí)驗(yàn)為探索NF-κB的抑制劑PDTC對(duì)于某些腫瘤細(xì)胞是否的確存在抑制作用，其作用的體內(nèi)外差異是否存在，這些問(wèn)題對(duì)于未來(lái)的腫瘤化療有著重要的意義。

體外MTT法發(fā)現(xiàn)PDTC對(duì)于Hca-F的增殖有明顯的抑制作用，在濃度為25 μg/mL時(shí)抑制率明顯較高。而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以小鼠為模型，觀察瘤重及其體積可發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)腫瘤并無(wú)明顯的抑制作用，反而大部分注射PDTC個(gè)體的瘤體積有增大的趨勢(shì)。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，可以反映氧化損傷的程度[11]，本實(shí)驗(yàn)中作為藥物療效的指標(biāo)，TNF-α是NF-κB的靶基因之一，檢測(cè)腫瘤組織勻漿中TNF-α水平以反映NF-κB活化情況，在本實(shí)驗(yàn)中PDTC治療組和攻擊對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不能排除藥物劑量低的可能性，也可能因?yàn)槟[瘤組織的氧化應(yīng)激水平不明顯。體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)與體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果差別很大，還可能與NF-κB的多功能和PDTC作用機(jī)制有關(guān)，因?yàn)镻DTC是通過(guò)抗氧化作用抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的NF-κB活化，對(duì)其他因素引起的NF-κB活化的抑制作用可能有限。NF-κB活化有其抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)增殖的作用，抑制其活化與功能在體外環(huán)境中可能有抗腫瘤作用，但NF-κB活化可促進(jìn)多種具有抗腫瘤作用的細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫，抑制NF-κB的功能對(duì)抗腫瘤免疫不利。確切機(jī)制有待深入研究。

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