陶鳳喜

(聊城市第三人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 聊城 252000)

宮頸癌是女性人群中第二大常見的惡性腫瘤，防治宮頸癌的方法就是早發(fā)現(xiàn)和早治療，目前利用細胞學(xué)涂片篩查宮頸癌前病變很大程度減低了宮頸癌的發(fā)病率和致死率。然而，由于其單純的細胞學(xué)篩查有很高的假陰性率而不能充分的檢測宮頸癌前病變狀態(tài)。P16INK4A基因是人們發(fā)現(xiàn)的一種直接作用于細胞周期，抑制細胞分裂的抑癌基因，生存素是凋亡抑制基因，其過度表達可以抑制內(nèi)源性或外源性凋亡途徑介導(dǎo)的細胞死亡[1]。本研究探討用P16INK4A和生存素作為區(qū)分CIN的不同分級病變和宮頸癌(SCC)的可行性。

1 材料和方法

1.1 材 料

通過回顧性研究2005年1月～2010年5月因?qū)m頸病變來聊城市第三人民醫(yī)院行宮頸活檢或手術(shù)的201例患者，年齡(57±12)歲,宮頸組織標(biāo)本包括組織活檢、宮頸錐形組織活檢、移形帶大部分環(huán)形切除標(biāo)本和整個子宮全切標(biāo)本，均經(jīng)病理結(jié)果證實，其中包括60例CIN1,21例CIN2,48例CIN3和72例SCC。CIN 1～3級為宮頸不典型增生，CIN 1 級細胞異型性輕，異型細胞僅占上皮層的下1/3；CIN 2級細胞異型性明顯，異型細胞限于上皮層的下2/3；CIN 3級細胞異型性顯著，異型細胞幾乎累及或全部累及上皮層。同期收治正常的宮頸組織10例作為對照組。

1.2 免疫組織化學(xué)方法

所有宮頸組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP法)進行免疫組織化學(xué)染色。鼠抗人p16蛋白單克隆抗體/鼠抗人生存素單克隆抗體、SP工作試劑盒購自上海尚寶生物科技有限公司。3，3-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(Diaminobenzidin，DAB)顯色試劑盒購自上海玉博生物科技有限公司。實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.3 結(jié)果判定

在光學(xué)顯微鏡下對涂片染色情況進行評估。P16INK4A光鏡下陽性物質(zhì)位于細胞核內(nèi)，亦可在胞質(zhì)，以細胞核染成棕色或棕黃色為陽性。在目標(biāo)區(qū)隨即選5個高倍鏡計數(shù)視野內(nèi)陽性細胞占細胞總數(shù)的百分比，<5%者為陰性表達， >5%而<50%為局灶或分散的陽性， >50%為彌散陽性[2]。所有結(jié)果均與病人的活檢標(biāo)本或手術(shù)切除標(biāo)本病理診斷相對照。生存素反應(yīng)性判讀：生存素的表達依靠染色強度分為2種類型：陰性：沒有染色細胞或分散的弱染色細胞；陽性：分散的中等強度染色細胞或所有細胞重度染色且分布于整個視野。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)處理采用χ2檢驗；Spearman等級相關(guān)分析做相關(guān)性檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 P16INK4A的表達

P16INK4A在所有正常的宮頸組織中未染色；CIN病變鄰近正常組織也沒有表達P16INK4A，P16INK4A在CIN1、CIN2、CIN3及SCC表達分別為25.0%、42.9%、85.8%、97.2%；見表1。P16INK4A在CIN3中的表達見圖1，陽性細胞占細胞總數(shù)的百分比>50%。P16INK4A表達與CIN病變分級程度具有正相關(guān)性(r=0.478,P<0.05)。

表1 P16INK4A和生存素在正常宮頸組織、CIN不同病變階段及SCC的表達情況

圖1 P16INK4A在CIN3中染色表達(×100)

2.2 生存素的表達

生存素在CIN1、CIN2、CIN3、SCC表達分別為56.7%、33.3%、67.5%及97.2%，見表1。其中在CIN3和SCC表達差異有顯著性意義(P<0.05)。生存素在CIN3中染色表達見圖2,分散的中等強度染色細胞或所有細胞重度染色且分布于整個視野。

圖2 生存素在CIN3中染色表達(×100)

3 討 論

研究證明，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與高危型HPV感染(HPV16、18)直接相關(guān)。P16INK4A反映HPV感染的類型，是預(yù)測CIN病變結(jié)局的合適的標(biāo)記。P16INK4A基因是在人染色體9p21發(fā)現(xiàn)的第一個直接參與細胞周期調(diào)控的抑癌基因,p16蛋白可與細胞周期素d競爭結(jié)合細胞周期依賴性激酶(cdk4)，使cdk4失活，從而阻止rb的磷酸化，去磷酸化的rb以活性形式結(jié)合e2f及atf2等轉(zhuǎn)錄因子，阻止細胞從G1期進入S期[3]。HPV16 癌基因產(chǎn)物E7 蛋白使Rb 失活從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子E2F活性升高，CDK-Rb-E2F 調(diào)控途徑被阻斷,導(dǎo)致抑癌基因INK4產(chǎn)物P16INK4A大量積累和高表達。在瑞典對HPV感染的五年隨訪研究發(fā)現(xiàn)HPV16和HPV18是導(dǎo)致CIN2或CIN3的最大潛在病變的危險因素[4]。

本文研究顯示，P16INK4A隨著CIN病變分級升高，陽性表達明顯增加，與CIN病變分級程度具有相關(guān)性(r=0.478,P<0.05)。在97.2%SCC病變中過度表達，進一步證實HPV感染和宮頸癌之間的因果關(guān)系密切。然而，少數(shù)宮頸癌患者不表達P16INK4A。Nieh等[5]研究顯示一定比例宮頸癌患者即沒有HPV感染也沒有P16INK4A的表達，對于在SCC病變中P16INK4A缺失表達可能解釋為P16INK4A啟動子甲基化導(dǎo)致P16INK4A基因沉默不表達。同時，本文研究顯示所有正常宮頸鱗狀上皮細胞弱生存素染色，在CIN3與SCC病變中陽性表達例數(shù)差異有顯著性意義(P<0.05)，可作為鑒別宮頸病變程度的指標(biāo)之一。Branca等[6]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)活檢組織CIN為持續(xù)陰性時，生存素過度表達是存在CIN的特異性指標(biāo)。

利用P16INK4A染色表達強度與CIN病變分級具有正相關(guān)性，生存素能用于區(qū)分CIN和SCC，因此在臨床診斷困難的情況下，可聯(lián)合檢測P16INK4A和生存素作為診斷CIN病變分級及SCC的輔助指標(biāo)之一。

參考文獻：

[1] Grossman D，Kim PJ，Blanc-Brude OP，et al.Transgenic expression of survivin in keratinocytes counteracts UVB-induced apoptosis and cooperates with loss of p53[J].J Clin Invest，2001，108(7):991-999.

[2] Redman R，Rufforny I，Liu C，et al.The utility of p16(Ink4a)in discriminating between cervical intraepithelial neoplasia 1 and nonneoplastic equivocal lesions of the cervix[J].Arch Pathol Lab Med，2008，132:795-799.

[3] Khoo CM,Carrasco DR,Bosenberg MW,et al.INK4a/Arf tumor suppressor does not modulate the degenerative conditions or tumor spectrum of the telomerase-deficient mouse[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(10):3931-3936.

[4] Schlecht NF，Kulaga S，Robitaille J，et al.Persistent human papillomavirus infection as a predictor of cervical intraepithelial neoplasia[J].JAMA，2001，286(24):3106-3114.

[5] Nieh S，Chen SF，Chu TY，et al.Is p16INK4Aexpression more useful than human papillomavirus test to determine the outcome of atypical squamous cells of undetermined significance-categorized Pap smear? A comparative analysis using abnormal cervical smears with follow-up biopsies[J].Gynecol Oncol，2005，97(1):35-40.

[6] Branca M，Ciotti M，Santini D， et al.p16INK4Aexpression is related to grade of cin and high-risk human papillomavirus but does not predict virus clearance after conization or disease outcome[J].Int J Gynecol Pathol，2004，23(4):354-365.