呂 莉，潘 平，韓國柱，周 琴，趙偉杰，王世盛，陸文婷

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 藥理教研室，遼寧 大連 116044；2.大連理工大學(xué) 精細(xì)化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116012；3.大連友誼醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連 116001)

藜蘆(Veratrumnigrum) 系百合科多年生草本植物，《神農(nóng)本草經(jīng)》及《本草綱目》等均有記載?！吨兴幋笤~典》等稱“藜蘆可用于治療中風(fēng)失語、黃疸、疥瘡”等[1]，由此提示藜蘆可能具有抗血栓等方面的作用。本研究組一直致力于研究烏蘇里藜蘆的有效成分及其藥理作用，既往研究表明從藜蘆中提得的總堿具有降壓[2]、改善血流動(dòng)力學(xué)[3,4 ]、中樞抑制作用[5]，并首次發(fā)現(xiàn)了藜蘆總堿具有強(qiáng)大的抗動(dòng)、靜脈血栓作用[6]。本工作組對其生物總堿進(jìn)行了一系列的化學(xué)成分研究，迄今已分離出11種酯型異甾體生物堿[7-9]，其中的一種單體經(jīng)用現(xiàn)代分析技術(shù)鑒定為計(jì)米丁(germidine)[10,11]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。本文旨在研究計(jì)米丁的抗動(dòng)脈血栓作用，從而確定烏蘇里藜蘆生物堿的抗血栓活性成分。

圖1 計(jì)米丁的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料和方法

1.1 藥物及試劑

鹽酸計(jì)米丁注射液(500 μg·mL-1)由大連理工大學(xué)化學(xué)制藥系提供；賴氨匹林(Aspirin-DL-Lysine,LAS)，安徽安寶藥廠產(chǎn)品；ADP，美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng) 物

SD大鼠，雄性，180～220 g，清潔級，大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號SCXK(遼)2008-0002。

1.3 儀 器

LBY-NJ2型普利生血液凝聚儀，北京普利生儀器公司產(chǎn)品；BT87-3型體內(nèi)血栓形成測定儀，包頭醫(yī)學(xué)院心血管研究室產(chǎn)品。

1.4 方 法

1.4.1 血流阻塞時(shí)間(OT)的測定

大鼠70只，隨機(jī)分為7組：生理鹽水(NS)組，計(jì)米丁1.3 μg·kg-1、2.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1和20.0 μg·kg-1組，以及陽性對照藥物賴氨匹林(LAS)18.0 mg·kg-1(相當(dāng)于阿司匹林10.0 mg·kg-1)組。大鼠腹腔注射烏拉坦1 g·kg-1麻醉，分離一側(cè)頸總動(dòng)脈，將體內(nèi)血栓形成儀的刺激電極置于頸總動(dòng)脈近心端，遠(yuǎn)心端置一溫度傳感器，大鼠舌下靜脈注射受試藥物后20 min以強(qiáng)度為1.6 mA直流電連續(xù)刺激頸總動(dòng)脈7 min，引起血管內(nèi)膜損傷，從而形成血栓。記錄從電刺激開始到溫度驟降所需時(shí)間，即血流阻塞時(shí)間(Occlusion Time,OT)[6,12]。以NS組為基準(zhǔn)，計(jì)算不同給藥組OT延長百分率。

1.4.2 體內(nèi)血小板聚集率的測定

大鼠60只，隨機(jī)分為6組：NS組，計(jì)米丁2.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1和20.0 μg·kg-1組，以及陽性對照藥物 LAS 18.0 mg·kg-1組。大鼠自尾靜脈注射受試藥物后20 min于麻醉狀態(tài)下自腹主動(dòng)脈取血，以3.8 %枸櫞酸鈉抗凝(血與抗凝劑體積比為9∶1)，以800 r/min離心10 min,取上清即獲得富血小板血漿(PRP),剩余血漿經(jīng)3000 r/min離心10 min，制備貧血小板血漿(PPP)。用PPP調(diào)PRP使其含血小板數(shù)為3×108·mL-1，以終濃度3 μmol·L-1的ADP為誘導(dǎo)劑，按Born法[13]于血液凝聚儀中測定血小板5 min最大聚集率。以NS組為基準(zhǔn)，計(jì)算不同給藥組血小板聚集抑制百分率。

1.4.3 體外血小板聚集率的測定

大鼠60只，按1.4.2項(xiàng)取血，制備PRP和PPP。用PPP調(diào)PRP血小板數(shù)至3×108·mL-1，于PRP中分別加入不同濃度受試藥物，使其終濃度分別為計(jì)米丁6.3 μg·L-1、12.5 μg·L-1、25.0 μg·L-1和50.0 μg·L-1,陽性對照藥LAS 40.0 mg·L-1，NS組加入等容量NS。再按1.4.2操作測定血小板5 min最大聚集率。以NS組為基準(zhǔn)，計(jì)算不同給藥組血小板聚集抑制率，并計(jì)算計(jì)米丁體外抑制血小板聚集的半數(shù)抑制濃度IC50。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 計(jì)米丁對大鼠電刺激頸動(dòng)脈血栓形成的影響

如表1所示，隨著計(jì)米丁給藥劑量的逐漸增大，OT值逐漸延長，且呈良好的量效關(guān)系。

表1 靜脈注射計(jì)米丁對大鼠動(dòng)脈血栓形成的影響

Tab 1 Effect of germidine (iv) on carotid artery thrombosis in rats

表1 靜脈注射計(jì)米丁對大鼠動(dòng)脈血栓形成的影響

1)與NS組相比,P<0.05；2)與NS組相比,P<0.01

組別OT(s)OT延長率(%)NS683.0±28.6-計(jì)米丁1.3 μg·kg-1794.9±49.21)16.4計(jì)米丁2.5 μg·kg-1869.7±58.72)27.3計(jì)米丁5.0 μg·kg-1913.6±32.72)33.8計(jì)米丁10.0 μg·kg-1982.9±49.72)43.9計(jì)米丁20.0 μg·kg-11133.7±198.52)66.0LAS 18.0 mg·kg-11040.2±53.32)52.3

2.2 計(jì)米丁對大鼠體內(nèi)、外血小板聚集率的影響

如圖2所示，NS組、計(jì)米丁2.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1組和LAS 18.0 mg·kg-1組大鼠5 min內(nèi)血小板最大聚集率分別為(69.9±3.3)%、(54.0±5.4)%、(42.0±5.7)%、(36.7±4.2)%、(25.9±5.1)%和(36.9±4.3)%。與NS組相比，計(jì)米丁從小到大劑量組血小板聚集抑制率分別為22.7%、39.9%、47.4%、62.9%(P<0.01)，LAS陽性對照藥LAS組血小板聚集抑制率為47.2%(P<0.01)。

如表2所示，隨著計(jì)米丁終濃度的增大，ADP誘導(dǎo)的大鼠5 min內(nèi)血小板最大聚集率值逐漸降低，與NS組相比，呈劑量依賴性地抑制ADP誘導(dǎo)的大鼠體外血小板聚集。計(jì)米丁終濃度25.0 μg·L-1與LAS 40.0 mg·L-1的作用強(qiáng)度相當(dāng)。以血小板聚集抑制率的概率單位(Y)對計(jì)米丁終濃度的對數(shù)(X)作圖，得線性回歸方程Y=1.26X+3.15(r=0.9980)，計(jì)算得計(jì)米丁在體外抑制血小板聚集的半數(shù)抑制濃度IC50=29.3 μg·L-1。

圖2 靜脈注射計(jì)米丁對大鼠體內(nèi)血小板聚集的影響

表2 計(jì)米丁對大鼠體外血小板聚集的影響

Tab 2 Effect of germidine on ADP induced platelet aggregation in vitro rats

表2 計(jì)米丁對大鼠體外血小板聚集的影響

1)與NS組相比，P<0.01；2)與LAS組相比，P>0.05

組別5 min內(nèi)血小板最大聚集率(%)抑制率(%)NS67.9±3.6-計(jì)米丁6.3 μg·L-154.8±4.51)19.4計(jì)米丁12.5 μg·L-145.1±3.81)33.6計(jì)米丁25.0 μg·L-136.6±4.51)2)46.1計(jì)米丁50.0 μg·L-126.3±3.51)61.3LAS 40.0 mg·L-139.3±3.71)42.2

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的整體動(dòng)脈血栓形成模型，首次研究了計(jì)米丁對實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈血栓形成的影響，并通過體內(nèi)、外血小板聚集率的測定初步探討計(jì)米丁的抗動(dòng)脈血栓作用機(jī)制。結(jié)果表明，大鼠靜脈注射計(jì)米丁后呈劑量依賴性延長OT，說明計(jì)米丁具有抑制動(dòng)脈血栓形成的作用。

本研究組曾報(bào)道，烏蘇里藜蘆總堿在7.2～42.9 μg·kg-1劑量范圍內(nèi)，其OT延長百分率為9.2%～95.8%；而計(jì)米丁在1.3～20.0 μg·kg-1劑量范圍內(nèi)，其OT延長百分率為16.4%～66.0%，提示計(jì)米丁可能是總堿中抗動(dòng)脈血栓形成的一種主要有效成分[6]。

本實(shí)驗(yàn)還表明計(jì)米丁具有一定的體內(nèi)、外血小板聚集抑制活性，且呈良好的量效關(guān)系。血小板聚集在動(dòng)脈血栓形成過程中起重要作用，計(jì)米丁具有顯著的抗血小板聚集的作用，提示可能與其抗動(dòng)脈血栓形成作用有關(guān)。

計(jì)米丁為自烏蘇里藜蘆總堿中提得的一種酯型甾體生物堿，有關(guān)其藥理作用，未見文獻(xiàn)報(bào)道。作為一種新型的天然藥物，在抗動(dòng)脈血栓、抗血小板方面，顯示了強(qiáng)大的作用，其有效劑量低至μg級水平，計(jì)米丁是烏蘇里藜蘆生物堿中一種重要的抗血栓活性成分，本研究為其作為高效能抗栓藥物的開發(fā)提供了廣闊的前景。其分子藥理學(xué)作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

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