高 斌 ，宓 真，杜馨麗，車海龍

遼寧省糖尿病治療中心，遼寧沈陽 110015

糖尿病仍屬終身疾病，傳統(tǒng)藥物治療難以阻止胰島β細(xì) 胞進行性衰竭，患者終身依靠胰島素治療亦不能阻止并發(fā)癥的進展。近年來的細(xì)胞移植治療，使得根治糖尿病有了新的曙光。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）能定向誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞，易于獲得及體外擴增，可以解決臨床胰島細(xì)胞供體缺乏難題，并且避免移植物免疫排斥反應(yīng)、涉及的醫(yī)學(xué)倫理學(xué)及法律問題[1]。但該研究尚處于初期階段，仍有許多問題需要解決，本研究通過SD大鼠尾靜脈注射重組腺病毒-綠色熒光蛋白（Ad-GFP）病毒感染的BMSC，從生化檢測、病理及免疫組織化學(xué)觀察等方面初步探討了同種異體BMSC移植對糖尿病大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

1.1.1 實驗動物 SD大鼠 （清潔級），24只， 體重150～200g，2個月齡，室溫18～25℃，自然光照射，購自沈陽藥科大學(xué)動物實驗室。

1.1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ；美國 sigma公司產(chǎn)品），DMEM-F12培養(yǎng)液 （Gibcol）， 胎牛清 （國產(chǎn)天津），Hanks液 （本實驗室自己配制），消化液：0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA 混合液（1∶1）；重組腺病毒 （Ad-GFP 上清）：北京諾賽基因組研究中心有限公司提供，血糖（葡萄糖氧化酶法，德國 BIOSEN C-Line，Clinic），胰島素（放免試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供），糖化血紅蛋白 （HbA1c）測定：比色法，試劑盒為南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病模型建立和分組 大鼠禁食12 h（不禁水），以2%STZ溶液[臨用前低溫（0℃）以pH=4.2的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配成]，45 mg/kg腹腔一次注射。造模后第7天乙醚輕度麻醉下采血（眶靜脈）測血糖。選血糖＞16.7 mmol/L 15只大鼠作為實驗對象。隨機分為實驗對照組：血糖（22.27±2.23）mmol/L，n=6；移植組：血糖（22.18±1.94） mmol/L，n=9。 造模前隨機抽取的5只正常對照組大鼠腹腔注射等量枸櫞酸鈉緩沖液。

1.2.2 骨髓液采集制備 正常SD大鼠經(jīng)20%烏拉坦5～9 ml/kg腹腔注射麻醉，無菌條件下摘取其兩側(cè)脛骨和股骨，用Hanks液（添加p 100 U/ml，s 100μg/ml）清洗兩遍。用咬骨鉗暴露骨髓腔，用注射器吸10 ml含10%胎牛血清DMEM-F12培養(yǎng)液，從骨髓腔沖洗出骨髓液，并收集。

1.2.3 BMSC培養(yǎng)擴增[2]將收獲的骨髓打散成為細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min，用含10%胎牛清DMEM-F12培養(yǎng)基重懸沉淀的細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度（3～5）×107接種于培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，100%濕度條件下進行培養(yǎng)。48 h后首次全量換液，72h半量換液。以后每3～4天換液1次。7～10 d當(dāng)形成一些較大細(xì)胞克隆時，用Hanks液清洗培養(yǎng)物2次，加入消化液（0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA混合液1∶1）數(shù)滴，置溫箱中消化，鏡下觀察細(xì)胞回縮，間隙增大時，加含10%胎牛血清DMEM-F12培養(yǎng)液停止消化。再按1∶3傳代接種到新培養(yǎng)瓶中，傳代后繼續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞再達80%～90%融合時，再行消化，獲得傳2代的BMSC。

1.2.4 GFP病毒感染傳代的BMSC[2]將傳2代獲得的BMSC每孔按2×105數(shù)量（2 ml）接種于 6孔板中。培養(yǎng) 72 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入Ad-EGFP的病毒上清并換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。1.2.5移植方法及相關(guān)檢測 經(jīng)篩選穩(wěn)定表達GFP的BMSC用于移植。移植組大鼠尾靜脈注射BMSC懸液0.4 ml，細(xì)胞數(shù)1×106～1×107/ml。實驗對照組及正常對照組大鼠尾靜脈注射生理鹽水。移植2周后采血測各組血糖、HbA1c、胰島素，并處死大鼠剖取胰腺，制作石蠟切片進行胰島素免疫組化及冰凍切片熒光倒置顯微鏡直接觀察GFP表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠血糖、HbA1c、胰島素比較

實驗2周，實驗對照組糖尿病大鼠血糖、HbA1c明顯高于正常對照組 （P＜0.001），胰島素明顯低于正常組 （P＜0.001）。移植組血糖、HbA1c低于實驗對照組，其中HbA1c差異顯著（P＜0.05），胰島素高于實驗對照組（P＞0.05）。 見表 1。

表1 三組大鼠血糖、HbA1c和胰島素比較（x±s）

2.2 三組病理觀察

正常對照組大鼠胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，在胰腺腺泡之間可見散在分布的胰島，圓形或橢圓形,色淺，胰島細(xì)胞呈團索狀分布，數(shù)量較多。免疫組化結(jié)果顯示，正常對照組胰島中心部胰島細(xì)胞的胰島素為強陽性，細(xì)胞內(nèi)可見深褐色粗大顆粒。實驗對照組胰島及胰島中心細(xì)胞數(shù)明顯減少。胰島素反應(yīng)基本陰性，僅見個別胰島細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量微弱淡黃色的細(xì)顆粒。移植組大鼠胰島中心部細(xì)胞增多，大部分胰島素反應(yīng)陽性或強陽性呈黃色或褐色顆粒。胰腺外分泌組織可見表達GFP的細(xì)胞，胰島中未發(fā)現(xiàn)其表達。

3 討論

研究證實胰腺移植可有效緩解糖尿病[3]，但由于胰腺和胰島移植存在供體缺乏、免疫排斥反應(yīng)等難題，促使學(xué)者們將研究重點轉(zhuǎn)移到了能分化成胰島素分泌細(xì)胞的干細(xì)胞的研究上。

骨髓來源的干細(xì)胞在體外和體內(nèi)能分化為胰島素分泌細(xì)胞[4]。BMSC能定向誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞[5-6]，易于獲得及體外擴增，可以解決臨床胰島細(xì)胞供體缺乏難題，并且避免移植物免疫排斥反應(yīng)、涉及的醫(yī)學(xué)倫理學(xué)及法律問題。但該研究尚處于初期階段，仍有許多問題需要解決，如分離純化問題、尚缺乏行之有效的定向誘導(dǎo)分化方案、移植時機及移植后的安全性問題等。由于誘導(dǎo)方法、條件、移植途徑不同，移植后對糖尿病大鼠治療結(jié)論不一[7-8]。BMSC直接移植入糖尿病大鼠體內(nèi)，能否分化為胰島β細(xì)胞，尚無結(jié)論性共識。有研究報道，BMSC移植能降低糖尿病大鼠血糖，升高血胰島素水平，組織學(xué)顯示有胰島再生，植入的BMSC在胰腺微環(huán)境發(fā)生遷移和再分布，向胰島β細(xì)胞方向分化[9]。

根據(jù)干細(xì)胞“歸巢”特性，BMSC會向病變處定向遷移。本研究采用大鼠骨髓體外貼壁分離培養(yǎng)、擴增方法，獲取傳2代的BMSC，用GFP標(biāo)記，經(jīng)同種異體糖尿病大鼠尾靜脈直接移植治療2周，觀察靜脈移植BMSC對糖尿病大鼠的作用，移植途徑方便。本實驗糖尿病模型是用STZ選擇性破壞胰島β細(xì)胞，使胰島素分泌減少，血糖升高。結(jié)果顯示移植組糖尿病大鼠血糖、HbA1c明顯下降，胰島素產(chǎn)生增加，胰島中心部細(xì)胞增多，大部分胰島素反應(yīng)陽性或強陽性呈黃色或褐色顆粒。胰腺外分泌組織可見表達GFP的細(xì)胞，但胰島中未發(fā)現(xiàn)其表達，不除外實驗手段的因素，關(guān)于BMSC在大鼠體內(nèi)遷移、分化，參與損傷胰島修復(fù)的具體機制有待進一步研究。

本研究提示同種異體BMSC經(jīng)尾靜脈直接移植可發(fā)揮有效的治療作用。與前述研究結(jié)果一致，可能通過內(nèi)源性胰島細(xì)胞增生發(fā)揮治療作用，為糖尿病細(xì)胞治療提供了新的途徑。

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