臧全金 趙波 賀西京 李浩鵬

傳統(tǒng)觀點認為成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)不可再生，一旦損傷，只能進行瘢痕修復(fù)。近年來中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在增殖細胞的發(fā)現(xiàn)打破了這一觀點，研究發(fā)現(xiàn)在成年哺乳動物體內(nèi)存在增殖細胞，以側(cè)腦室下區(qū)（SVZ區(qū)）以及海馬齒狀回為最多[1-2]；損傷后，腦組織及脊髓組織生成神經(jīng)干細胞來對損傷部位進行修復(fù)。近年來研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞除了形成膠質(zhì)瘢痕外，在受到損傷刺激后能夠表達神經(jīng)干細胞的特異性標記物神經(jīng)上皮干細胞蛋白(neuroepithelial stem cell protein)又名nestin蛋白物[3-5]，體外培養(yǎng)能夠形成神經(jīng)球。星形膠質(zhì)細胞的增生是否和神經(jīng)干細胞有關(guān)、星形膠質(zhì)細胞是否能夠表達干細胞的功能尚且不得而知，因此研究損傷后兩者之間的表達變化及其關(guān)系有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 側(cè)腦室下區(qū)神經(jīng)干細胞的培養(yǎng) 頸椎脫臼處死大鼠，取側(cè)腦室下區(qū)細胞。機械性分離過濾。酶化學(xué)法分離細胞，細胞濃度2×105/ml接種于含bFGF、B27的無血清培養(yǎng)基中。于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察換液。對形成的細胞行nestin免疫細胞熒光化學(xué)染色鑒定。

1.2 建立腦損傷模型 利用自制的Feeney裝置，自由落體打擊大鼠腦部。

1.3 腦損傷后行免疫組化及免疫熒光染色：成年SD大鼠48只，雌雄各半，200～250g。隨機分為正常組（6只）、假手術(shù)組以及模型組（42只）。模型組分為腦損傷后3d、5d、7d、2w、3w、4w組。動物取材前24h由腹腔注射生理鹽水溶解的BrdU，劑量200mg/kg。灌注取材，制作冰凍組織切片。組織切片進行BrdU、GFAP及nestin的免疫組織化學(xué)以及GFAP和nestin的免疫熒光雙重標記染色。

1.4 圖像采集 采集側(cè)腦室下區(qū)5個視野, 測量單位面積BrdU、nestin、GFAP吸光度(A)值的變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包,對BrdU、nestin、GFAP在腦損傷不同時間點側(cè)腦室下區(qū)中的免疫染色結(jié)果進行比較,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。采用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)結(jié)果 倒置相差顯微鏡下觀察細胞懸液：細胞呈圓形，體積較小，胞體透明，折光性強。培養(yǎng)后逐漸可見部分懸浮細胞開始分裂。并逐漸形成神經(jīng)球。神經(jīng)球行nesin免疫熒光染色鑒定顯示：神經(jīng)球呈nesin+反應(yīng)（圖1、圖2）。

2.2 模型建立 應(yīng)用Feeney模型成功制作出損傷程度較一致的腦損傷模型。

圖1 細胞培養(yǎng)后可見形成神經(jīng)球

圖2 神經(jīng)球FITC標記nestin染色陽性

2.3 免疫染色結(jié)果 GFAP+星形膠質(zhì)細胞普遍存在于正常組腦中，但是損傷后細胞腫脹、肥大,突起增多，變長。正常組SVZ區(qū)可見少量nestin+細胞，胞體較細小，突起較長，染色較弱。損傷后3d開始染色變深，陽性細胞增多。且在第7d陽性細胞數(shù)量最多，從第2周開始細胞數(shù)量開始減少。在第4周GFAP+細胞以及nestin+細胞數(shù)量逐漸減少至正常水平，細胞形態(tài)和正常組相比基本一致。各時間點免疫熒光雙重標記未見有GFAP、nestin雙表達，所見均為單標陽性（圖3）。

圖3 腦損傷后2周SVZ區(qū)FITC標記的nestin和TRITC標記的GFAP雙重染色，未見雙重染色細胞，其他各時間點亦未見雙重染色細胞（10×20）

表1 腦損傷后各時間點與正常組、假手術(shù)組各指標吸光度（A值）的比較

2.4 統(tǒng)計學(xué)結(jié)果

如表1所示：腦損傷后3d到2w側(cè)腦室下區(qū)BrdU、GFAP以及nestin表達與正常組相比都有統(tǒng)計學(xué)意義（與正常組比較P＜0.05），損傷后3w GFAP、nestin與正常組相比也具有統(tǒng)計學(xué)意義。損傷后4w以及假手術(shù)組與正常組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

正常組和腦損傷后不同時間點的成年大鼠在神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)中都能夠形成克隆球，并且免疫鑒定為nestin陽性。損傷組較正常組較增殖能力弱，形成克隆球的速度明顯快。單細胞克隆法傳代后發(fā)現(xiàn)仍然能夠形成神經(jīng)克隆球，免疫鑒定為陽性，說明具有穩(wěn)定傳代的能力，具有神經(jīng)干細胞的增殖特性。損傷后各時間點BrdU陽性細胞明顯增多，并且從側(cè)腦室下區(qū)向周圍進行遷移，損傷后增殖細胞數(shù)量增多，并且向損傷部位進行遷移，可能對損傷修復(fù)起重要作用。GFAP陽性細胞在正常即存在于大腦各個部位，在損傷后反應(yīng)性地增多，與傳統(tǒng)觀點損傷后星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增多相符合。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GFAP陽性細胞在損傷后第3d開始增多，第7d增生最明顯。Nestin為神經(jīng)干細胞的標記物，陽性說明細胞為神經(jīng)干細胞。BrdU、GFAP、nestin三者損傷后都較正常組都增多，并且在3、5、7d時增生顯著，7d時最明顯，表明星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)干細胞之間可能具有某種關(guān)系。應(yīng)用GFAP和nestin雙重標記損傷后組織，在側(cè)腦室下區(qū)未見到GFAP+/nestin+雙重標記細胞，說明兩者之間可能存在關(guān)系，但不能表明星形膠質(zhì)細胞表達干細胞的功能。關(guān)于星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)干細胞之間的關(guān)系有2種可能:一種是星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生，逆向分化表達神經(jīng)干細胞的功能；另一種可能是神經(jīng)干細胞部分分化表達星形膠質(zhì)細胞的功能。這兩者之間的關(guān)系尚需要進一步的研究。

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