王桂桂 馬延祥

食物過敏是一種較常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病，在發(fā)達(dá)國家已被視為一個(gè)主要的健康問題[1]。已有的研究表明，食物過敏輕者可引起皮膚、胃腸道過敏癥狀，重者可致哮喘發(fā)作、休克甚至死亡。嬰幼兒期患過食物過敏的小兒，在小學(xué)時(shí)期的身高明顯低于正常同齡兒[2]。由于食物過敏發(fā)病率較高，對(duì)人類健康危害性較大，研究食物過敏的病因、發(fā)生機(jī)制、臨床表現(xiàn)和診斷措施，已成為近年國內(nèi)外學(xué)者十分關(guān)注的課題，但有關(guān)應(yīng)用有效藥物積極防治食物過敏的研究，至今尚不多見。為此，我們應(yīng)用卵清蛋白建立小鼠腸道致敏模型，觀察單味中藥燈籠草對(duì)小鼠消化道過敏反應(yīng)的影響，探尋臨床上能夠有效防治兒童食物過敏的藥物。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器與動(dòng)物 卵清蛋白(ovalbumin OVA)、氫氧化鋁、甲苯胺蘭等（Sigma公司），IgE、ALT、?-干擾素（IFN-?）、白介素5（IL-5）試劑等（上海藍(lán)基生物科技有限公司），燈籠草（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部供應(yīng)科）。所用儀器均來自延邊大學(xué)附屬醫(yī)院檢測(cè)中心實(shí)驗(yàn)室。生長條件相同、無雞蛋喂養(yǎng)、6～8周齡，體重16～18g，BALB/C♀小鼠(SPF級(jí)，延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與藥物制備 將64只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Control）、模型組（Model），灌服高、中、低濃度燈籠草預(yù)防組（YH、YM、YL組），灌服高、中、低濃度燈籠草治療組（TH、TM、TL組）。按照傳統(tǒng)中藥煎劑制備方法，取燈籠草全草100g，加入500ml雙蒸水，浸泡20min后，加熱煎煮至150ml，用紗布濾去藥渣，再用文火將該煎劑濃縮為100ml的浸膏，分裝于無菌小瓶內(nèi)，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?00g生藥制成100ml定為100%濃度，并將藥物濃度分為高(100%)、中(50%)、低(25%)三個(gè)濃度。

1.2.2 建立0VA致敏小鼠模型 基礎(chǔ)致敏：實(shí)驗(yàn)第1天，對(duì)Y組、T組和ModeL組的每只小鼠，腹腔注射含有10ug OVA及l(fā)mg氫氧化鋁的無菌生理鹽水0.5ml，ControL組腹腔注射等量無菌生理鹽水。強(qiáng)化致敏：實(shí)驗(yàn)第15天，對(duì)Y組和Model組每只小鼠，腹腔注射含20ug OVA的無菌生理鹽水0.5m1；Control組腹腔注射無菌生理鹽水0.5m1。激發(fā)腸道過敏：實(shí)驗(yàn)第20、25、30天，分別以O(shè)VA生理鹽水0.5ml(OVA濃度為50mg/ml)，對(duì)Model、Y、T組每只小鼠進(jìn)行灌胃激發(fā)，ControL組小鼠同時(shí)以等量生理鹽水灌胃。

1.2.3 給藥 每只小鼠灌服的燈籠草水提物劑量（以下簡稱燈籠草），均按每次0.3ml/10g體重，每日2次，共10d，其中，Y組于實(shí)驗(yàn)前7天開始灌服，T組于實(shí)驗(yàn)開始第20天開始灌服。

1.2.4 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)第30天，摘除小鼠眼球取血，分離血清，放入-70℃的冰箱中保存?zhèn)溆?；取完眼球血后，將小鼠四肢固定于案板上，切開腹部皮膚并暴露腹腔組織，取十二指腸Treitz韌帶以下5cm的小腸0.5cm，用冷生理鹽水清洗，再浸入10%福爾馬林中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片4um，做HE染色和甲苯胺藍(lán)染色。

1.2.5 主要觀察指標(biāo) 血清OVA特異性IgE水平（OD值），采用ELISA法；血清ALT（U/L）檢測(cè)采用賴氏法：用UV-8500熒光分光光度劑，于波長505nm處檢測(cè)吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算成ALT值；形態(tài)學(xué)觀察及肥大細(xì)胞完整率采用病理顯微圖像分析儀進(jìn)行小腸粘膜組織形態(tài)學(xué)觀察與分析；隨機(jī)連續(xù)計(jì)數(shù)小腸切片10個(gè)高倍視野內(nèi)的肥大細(xì)胞數(shù)目，取平均值代表其密度，并同時(shí)累計(jì)肥大細(xì)胞總數(shù)及脫顆粒數(shù)。IL-5和IFN-?的表達(dá)強(qiáng)度對(duì)小腸組織病理標(biāo)本行免疫組化染色(sABC法)，參照Hayashi等標(biāo)準(zhǔn)[3]，將 IL-5和IFN-?免疫組化染色切片的表達(dá)強(qiáng)度行半定量評(píng)分：0分（細(xì)胞未著色）；1分（淺黃色）；2分（淺棕黃色）；3分（棕黃色）；4分：（棕褐色）。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件，采用單因素方差和非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用LSD法，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HE染色結(jié)果 模型組：小腸絨毛上皮細(xì)胞出現(xiàn)局灶性壞死、脫落，固有層明顯水腫、血管充血；TH、TM、YH、YM組：小腸上皮脫落減少，炎癥細(xì)胞浸潤較模型組明顯減輕。YL、TL組：小腸炎癥程度與模型組相近。

表1 各組小鼠觀察指標(biāo)結(jié)果（n=8,±s）Table 1 Change of index in mice（n=8, ±s）

表1 各組小鼠觀察指標(biāo)結(jié)果（n=8,±s）Table 1 Change of index in mice（n=8, ±s）

注：Compared with Model group：*P＜0.01;compared with control group: ▲P＜0.01；compared with Y group and T group：■P＞0.05。注：與Model組比較*P＜0.01; 與control組比較▲P＜0.01；Y組與T組比較■P＞0.05。

Groups Integrality of mast cell (%) IgE（OD） IL-5(marks) IFN-?(marks) ALT(U/L)control 84.7±6.79 0.81±0.04 1.47±0.14 1.21±0.04 39.63±3.91*Model 48.6±5.34▲ 1.01±0.03▲ 2.99±0.05▲ 2.91±0.09 79.63±6.82 YH 70.5±6.77*■ 0.86±0.02*■ 2.35±0.02*▲■ 2.33±0.04*▲■ 37.88±3.85*■YM 63.5±3.08*■ 0.87±0.02*■ 2.50±0.04*▲■ 2.43±0.05*▲■ 38.38±3.53*■YL 37.0±4.64▲■ 0.99±0.04▲■ 2.96±0.06▲■ 2.86±0.08▲■ 57.75±7.08*■TH 78.6±4.90* 0.78±0.05* 2.21±0.02*▲ 2.19±0.04*▲ 39.63±2.88*TM 65.4±4.30* 0.83±0.05* 2.33±0.03*▲ 2.28±0.05*▲ 43.00±5.99*TL 38.0±4.36▲ 0.96±0.06▲ 2.81±0.05▲ 2.85±0.06▲ 43.63±6.14*

甲苯胺蘭染色結(jié)果 模型、YL、TL組：小鼠小腸固有層肥大細(xì)胞聚集，多數(shù)肥大細(xì)胞胞膜破裂，輪廓不清，并向外排除顆粒；YH、YM、TH、TM組：小鼠小腸固有層肥大細(xì)胞聚集及脫顆粒現(xiàn)象較模型組明顯緩解。

各組小鼠觀察指標(biāo)結(jié)果請(qǐng)見表1。

各組間比較結(jié)果：小腸肥大細(xì)胞完整率（%）：模型組明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；YH、YM組均明顯高于模型組（P＜0.01）；但Y與T組之間未見顯著性差異（P＞0.05），進(jìn)一步提示高、中濃度的燈籠草，能夠有效保持肥大細(xì)胞的完整，減少肥大細(xì)胞脫顆粒，且肥大細(xì)胞完整率與燈籠草的濃度有關(guān)。

血清IgE水平（OD值）：模型組明顯高于其他各組（P＜0.01）；YH、YM組均明顯高于模型組（P＜0.01）；Y組的IgE水平雖在數(shù)值上優(yōu)于相同濃度的T組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上未見顯著性差異（P＞0.05）。提示高、中濃度預(yù)防組小鼠，血清IgE水平與治療組一樣，均顯著低于模型組，并接近正常對(duì)照組的水平。

小鼠腸組織IL-5和IFN-?表達(dá)強(qiáng)度：模型組小鼠IL-5和IFN-?含量均明顯升高（P＜0.01）；YH、YM組均明顯低于模型組（P＜0.01）；Y組的IL-5和IFN-?水平在數(shù)值上也優(yōu)于相同濃度治療組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

各組小鼠ALT水平：模型組小鼠ALT水平明顯升高；YH、YM組的ALT水平均明顯低于模型組，差異具有顯著性（P＜0.01）；相同燈籠草濃度在Y組與T組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

對(duì)人類健康構(gòu)成威脅的食物過敏原，主要來自食物中含有的致敏蛋白質(zhì)、食物加工儲(chǔ)存中使用的食品添加劑和含有過敏原的轉(zhuǎn)基因食品[4]。目前已知食物過敏的主要影響因素包括：遺傳因素、喂養(yǎng)情況、孕期飲食及吸煙情況，但因?yàn)槿祟愂澄锲贩N繁多，地區(qū)、季節(jié)、個(gè)人飲食習(xí)慣又各不相同，診斷和治療都存在一定困難[5]。

以往的研究結(jié)果已證實(shí)：某些細(xì)胞因子，在食物過敏反應(yīng)中起重要作用，如：血清特異性IgE水平、嗜酸性粒細(xì)胞及組胺含量、肥大細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子或直接引起胃腸效應(yīng)，或活化狀況（通常以肥大細(xì)胞完整率表達(dá)）、相關(guān)組織中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-?的表達(dá)[6]。因此，檢測(cè)這些相關(guān)的細(xì)胞或細(xì)胞因子的含量水平，追蹤觀察其變化情況，對(duì)于及時(shí)診斷食物過敏性疾病和臨床療效的判定，甚至預(yù)防作用的確立，都具有較重要的意義。

IgE介導(dǎo)的速發(fā)型食物過敏是主要的過敏反應(yīng)，其顯著特征是：無害的食物過敏原間接引起特異性IgE的產(chǎn)生。肥大細(xì)胞參與了腸道粘膜功能的調(diào)節(jié)，脫顆粒釋放的介質(zhì)引起炎癥反應(yīng)，食物特異性IgE常常在尚未出現(xiàn)臨床癥狀前就已經(jīng)存在。因此，測(cè)定血清食物特異性IgE，是目前公認(rèn)的食物過敏的診斷和預(yù)測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)成功建立了IgE介導(dǎo)的OVA過敏小鼠模型，并再次證實(shí)：模型組小鼠血清特異性IgE水平確實(shí)明顯升高，腸道粘膜出現(xiàn)大量肥大細(xì)胞聚集、脫顆粒，絨毛上皮細(xì)胞局灶性壞死、脫落，固有層明顯水腫、血管充血[7]。

燈籠草為茄科帶萼果實(shí)植物，盛產(chǎn)于我國許多地區(qū)，民間常用于治療咽喉腫痛、腮腺炎、肺熱咳嗽、泌尿道炎癥等病癥，是采集服用方便、無明顯不良反應(yīng)的果、藥兩用資源[8]。已有的研究結(jié)果表明：燈籠草能夠明顯緩解哮喘小鼠肺和過敏小腸組織的炎癥，對(duì)致敏小鼠的免疫性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用；能夠降低肺組織中IL-5和IFN-r的表達(dá)，且存在明顯的量效關(guān)系[9-11]。

本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，高、中濃度的燈籠草，可以明顯地緩解肥大細(xì)胞聚集、脫顆?，F(xiàn)象，緩解小腸炎性。其中，預(yù)防組的IgE、ALT、IL-5和IFN-?水平，均明顯低于模型組，肥大細(xì)胞完整率明顯高于模型組；預(yù)防組的IgE、IL-5和IFN-?水平，在數(shù)值上優(yōu)于相同濃度的治療組；但各個(gè)觀察指標(biāo)在預(yù)防組與治療組之間，均未見顯著性差異。

通過復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)我們認(rèn)為，高、中濃度的燈籠草降低過敏小鼠IgE水平及IL-5的表達(dá)，可能通過調(diào)控過敏小鼠體內(nèi)Th3等調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群，進(jìn)而下調(diào)體內(nèi)高水平的IL-5，發(fā)揮抗過敏作用。另一方面，燈籠草也可能直接降低腸道通透性，減少了通過腸道與肥大細(xì)胞結(jié)合的OVA過敏原數(shù)量，使IL-5的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于激發(fā)組，從而降低小鼠發(fā)生Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)，維持小鼠的Th2/Th1平衡狀態(tài)，發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

當(dāng)食物過敏反應(yīng)發(fā)生時(shí)，腸道的通透性增加，仍具有抗原性的食物可被吸收，通過門靜脈進(jìn)入肝臟而誘發(fā)免疫反應(yīng)，損傷肝臟組織。ALT主要存在于肝細(xì)胞中，其活性的高低，是肝功能受損或恢復(fù)的特異性指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)：高、中濃度的預(yù)防組和治療組的ALT水平，均明顯低于模型組，提示燈籠草對(duì)免疫性肝損傷具有明顯的預(yù)防和保護(hù)作用。

綜上所述，高、中濃度的燈籠草，可以明顯緩解小鼠過敏引起的消化道炎癥，預(yù)防組緩解消化道過敏性炎變的表現(xiàn)與治療組的作用相似。燈籠草對(duì)食物過敏具有明顯地調(diào)節(jié)和緩解作用，但不能完全預(yù)防小鼠的消化道過敏反應(yīng)。燈籠草可能是用于防治兒童食物過敏的有效藥物，具有較高的臨床研究價(jià)值。

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