王 文,張 娟,員麗娟,季新成*

(1.新疆動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,新疆烏魯木齊 830063;2.奇臺(tái)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,新疆奇臺(tái) 831800;3.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局,新疆烏魯木齊 830063)

牛病毒性腹瀉病毒血清抗體檢測(cè)

王 文1,張 娟2,員麗娟3,季新成*3

(1.新疆動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,新疆烏魯木齊 830063;2.奇臺(tái)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,新疆奇臺(tái) 831800;3.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局,新疆烏魯木齊 830063)

采用Svanova公司牛病毒性腹瀉病毒血清抗體ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)采自新疆10個(gè)不同地區(qū)的875份牛血清進(jìn)行了牛病毒性腹瀉病毒血清抗體檢測(cè),共檢出抗體陽(yáng)性血清759份,最高陽(yáng)性率為100%,最低為55.0%,平均為86.7%。檢測(cè)結(jié)果表明該病已在新疆普遍存在,感染沒有明確的地域分布規(guī)律。根據(jù)ELISA檢測(cè)結(jié)果,從中選擇15份血清用病毒中和試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,所采用的ELISA檢測(cè)方法具有較好的敏感性。

牛病毒性腹瀉病毒;血清抗體;ELISA;病毒中和試驗(yàn)

*通訊作者

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)又稱牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,BVD-MDV),或黏膜病病毒(Mucosal disease virus,MDV),是導(dǎo)致牛流產(chǎn)、死胎和畸形胎等的重要病原之一,持續(xù)性感染BVDV的牛,雖然血清中病毒抗體呈陰性,但卻終身帶毒排毒。同時(shí),BVDV還是牛源生物制品(血清、凍精、冷凍胚胎及疫苗等)的常在污染源。牛病毒性腹瀉病主要發(fā)生于牛,犢牛更易感。臨床癥狀主要為高熱、白細(xì)胞減少,大量流涎、腹瀉、減奶甚至停奶,結(jié)膜炎、口腔黏膜充血并出現(xiàn)潰瘍斑。通常發(fā)病率高,病死率低,但急性發(fā)作型病死率甚高。

本病是由美國(guó)的Olafsan于1946年首次在紐約奶牛中發(fā)現(xiàn)的,是歐美各國(guó)奶牛和肉牛群的常發(fā)病,對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的危害。該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布,給畜牧業(yè)和相關(guān)商業(yè)領(lǐng)域造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。我國(guó)從20世紀(jì)80年代調(diào)查發(fā)現(xiàn)在牛群中存在BVD,其后在全國(guó)20多個(gè)省、市都相繼發(fā)現(xiàn)了該病的存在[2]。新疆奶牛養(yǎng)殖數(shù)量位于全國(guó)前列,因此調(diào)查了解新疆地區(qū)該病的發(fā)生與流行情況,十分必要。本研究對(duì)采自新疆不同地區(qū)的875份牛血清進(jìn)行了BVDV抗體檢測(cè),為該病的有效防控提供技術(shù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 牛病毒性腹瀉病毒血清抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒為瑞典Svanova公司產(chǎn)品;牛病毒性腹瀉病毒(C24V)、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清、MDBK細(xì)胞,均為中國(guó)獸藥監(jiān)察所產(chǎn)品;MEM細(xì)胞培養(yǎng)基和新生馬血清,為Gibico公司產(chǎn)品;EXL800酶標(biāo)儀為Bio-rad公司產(chǎn)品,不同量程微量加樣器為eppendorf公司產(chǎn)品。

1.1.2 樣品來源 被檢血清樣品875份,分別采自新疆伊犁州、昌吉州、哈密地區(qū)、塔城地區(qū)和石河子市等10個(gè)不同地區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體及結(jié)果判定 875份被檢牛血清樣品按 Svanova公司ELISA試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

結(jié)果成立條件:陽(yáng)性對(duì)照的平均值(PCx)與陰性對(duì)照平均值(NCx)之差(P-N)必須大于或等于0.150的吸光值(OD),另外,陰性對(duì)照平均值(NCx)必須小于或等于0.250的吸光值(OD),檢測(cè)結(jié)果有效。按以下公式計(jì)算S/P:

式中:SampleA450——被測(cè)樣品在450 nm下的OD均值;NCx450——陰性對(duì)照在450 nm下的OD均值;PCx450——陽(yáng)性對(duì)照在450 nm下的OD均值。

S/P值小于0.2的被檢樣品判為BVDV抗體陰性;S/P值大于或等于0.2,但小于0.3,被檢樣品判為BVDV抗體可疑,應(yīng)重新檢測(cè),若再次為可疑則判為陽(yáng)性;S/P值大于或等于0.3的被檢樣品判為BVDV抗體陽(yáng)性。

1.2.2 中和試驗(yàn)(VN)對(duì)血清抗體效價(jià)的檢測(cè)

根據(jù)ELISA檢測(cè)結(jié)果,從中有代表性的選取15份血清樣品(12份陽(yáng)性、2份陰性、1份可疑),用病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體效價(jià),以對(duì)兩種檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,血清按2倍連續(xù)倍比稀釋,做6個(gè)稀釋度(2-1～2-6)。操作方法見文獻(xiàn)[3]。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)結(jié)果

通過對(duì)采自新疆10個(gè)地區(qū)(牛群)的875份牛血清進(jìn)行 BVDV抗體檢測(cè),共檢出陽(yáng)性血清759份,結(jié)果顯示這些地區(qū)牛群中都不同程度的存在BVDV的感染,最高陽(yáng)性率達(dá)100%,最低陽(yáng)性率為55.0%,平均陽(yáng)性率為86.7%。從本次結(jié)果來看,陽(yáng)性分布沒有明確的地域特征。牛場(chǎng)1為分3次不同時(shí)間采樣檢測(cè),牛場(chǎng)3為2次采樣,結(jié)果顯示其后的時(shí)間陽(yáng)性率呈明顯的上升趨勢(shì)。從有過流產(chǎn)史記錄的4個(gè)牛場(chǎng)檢測(cè)數(shù)據(jù)來看,陽(yáng)性率基本達(dá)100%,一定程度上表明該病導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。從所檢測(cè)的樣品來看,結(jié)果顯示該病已在全新疆普遍存在,且有不斷增強(qiáng)的趨勢(shì)(表1)。

2.2 ELISA與病毒中和試驗(yàn)比較

從檢測(cè)數(shù)據(jù)判斷,15份被檢血清樣品中,VN檢出陽(yáng)性樣品10份,最高血清滴度為2-6,呈較強(qiáng)的陽(yáng)性,ELISA試劑盒檢出陽(yáng)性樣品12份,可疑樣品1份,與VN檢測(cè)方法符合率為80.0%,VN檢測(cè)為陰性的血清樣品與之對(duì)應(yīng)的ELISA檢測(cè)都具有較低的OD值或處于可疑范圍之內(nèi)。從以上結(jié)果來看,兩種檢測(cè)方法具有一定的線性關(guān)系,但ELISA的敏感性較高(表2)。

表1 牛血清樣品分布及BVDV抗體檢測(cè)結(jié)果Table 1 Serum samples distribution and antibody results to BVDV

表2 15分血清樣品BVDV抗體ELISA檢測(cè)和VN檢測(cè)結(jié)果Table 2 15 serum samples antibody results detected by ELISA and VN respectively

3 討論

牛病毒性腹瀉在世界范圍內(nèi)廣泛分布,20世紀(jì)80年代,李佑民等首次報(bào)道了從國(guó)內(nèi)牛流產(chǎn)胎兒脾臟分離出BVDV,證實(shí)了我國(guó)也存在著本病。2005年河北省8個(gè)大型奶牛場(chǎng)BVDV血清抗體檢測(cè),總陽(yáng)性率42.6%[4],楊得勝等[5]2006對(duì)福建省9個(gè)地區(qū)大型牛場(chǎng)和散養(yǎng)戶牛進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查,總陽(yáng)性率達(dá)92.5%,表明我國(guó)不同地區(qū)廣泛存在該病的發(fā)生與流行。由于BVDV可通過口鼻接觸及血液等多種途徑傳播,且感染BVDV的牛發(fā)病率高、死亡率低,因此牛群中相當(dāng)一部分牛是BVDV的攜帶者。感染BVDV的孕牛產(chǎn)下的小牛對(duì)BVDV有免疫耐受性,可持續(xù)感染BVDV,最終有可能發(fā)展成致死性的黏膜病而死亡[6]。當(dāng)已感染的牛免疫機(jī)制受到抑制時(shí),無論其體內(nèi)是否存在病毒或抗體,都會(huì)向外界排毒,病?？祻?fù)后長(zhǎng)期帶毒就成為長(zhǎng)期的潛在傳染源。因此可以認(rèn)為,在非免疫牛的血清中檢測(cè)出BVDV抗體,就可確認(rèn)牛體中有BVDV的存在,并有排毒的可能性[7-8]。

BVDV抗體常用檢測(cè)方法有VN和ELISA,與病毒VN相比,ELISA檢測(cè)方法極大的縮短了檢測(cè)時(shí)間,且具有敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn),是進(jìn)行血清流行病學(xué)調(diào)查的良好方法[9-10]。我們對(duì)15份被檢血清同時(shí)進(jìn)行了ELISA法和VN法檢測(cè),VN陽(yáng)性檢出率較低,與 ELISA檢測(cè)方法符合率為80.0%。

我們采用了Svanova公司的ELISA試劑盒對(duì)新疆奶牛病毒性腹瀉進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查,本次采集的被測(cè)樣品來自南疆和北疆不同地區(qū),具有一定的代表性。結(jié)果表明在所調(diào)查的地區(qū)中均存在牛病毒性腹瀉病毒感染,進(jìn)一步證明該病在新疆地區(qū)的廣泛存在。調(diào)查結(jié)果對(duì)該病的了解和防控具有重要意義,為促進(jìn)新疆牛出口,合理選擇出口牛群具有積極作用。

[1]張俊杰,凌宗帥,黃 凱,等.北京地區(qū)規(guī)模化奶牛場(chǎng)牛病毒性腹瀉病血清學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)奶牛,2010(10):41-42.

[2]張會(huì)敏,鄭明學(xué),古少鵬,等.牛病毒性腹瀉的流行情況及防制[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2009,36(11):120-122.

[3]OIE.Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals[M].T he Animal Health&Production Compendium,2010:698-711.

[4]高存福.秦建華,趙月蘭,等.牛病毒性腹瀉病毒雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2005,35(8):620-622.

[5]楊得勝,黃 雁,洪 英,等.2006年福建省牛病毒性腹瀉病的血清學(xué)調(diào)查明[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28(9):49-51.

[6]Brownlie J.Clinical aspects of the bovine virus diarrhoea/mucosal disease complex in cattle[J].In Practice,1985(7):195-202.

[7]Palfi V,Houe H,Philipsen J.Studies on the decline of bovine virus diarrhea virus(BVDV)maternal antibodies and detectability of BVDV in persistently infected calves[J].Acta Vet Scand,1993(34):105-107.

[8]Moenning V,F rey H R,Lieber E,et al.Reproduction of mucosal disease with cytopathogenic bovine viral diarrhea virus selected in vitro[J].Vet Rec,1990(127):200-203.

[9]Brinkhof J,Zimmer G,Westenbrink F,et al.Comparative study of four enzyme-linked immunoso rbent assays and a cocultivation assay for the detection of antigens associated with the bovine viral diarrhoea virus in persistently infected cattle[J].Vet Microbiol,1996(50):1-6.

[10]Graham D A,Beggs N,Mawhinney K,et al.Comparative evaluation of diagnostic techniques for bovine viral diarrhoea virus in aborted and stillborn fetuses[J].Vet Rec,2009,164:56-58.

Serum Antibody Detection of Bovine Viral Diarrhea Virus

WANG Wen1,ZHANG Juan2,YUAN Li-juan3,JI Xin-cheng3

(1.Xinjiang Animal Health Supervise Station,Urumqi,Xinjiang,830063,China;
2Qitai County Animal Disease Prevent and Control Centre,Qitai,Xinjiang,831800;
3.Xinjiang Exit-import Inspection and Quarantine Bureau,Urumq,Xinjiang,830063,China)

In the study,875 serum samples came from 10 different areas or farms,antibody against Bovine viral diarrhea virus(BVDV)was detected used svanova company indirect ELISA kit,759 serum samples were conformed positive.The positive rate was between 55.0%and 100%,and the mean positive rate was 86.7%.The results showed that BVDV is extensive exist in Xinjiang province,and the infection rate no obvious different among different regions.15 samples were chosen and tested by virus neutralization(VN)method,the results showed that the ELISA detection was more sensitive compared with VN test.

BVDV;serum antibody;ELISA;VN

S852.659.6

A

1007-5038(2011)09-051-03

2011-04-08

新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展項(xiàng)目(201010101);國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科研項(xiàng)目(2011IK017)

王 文(1968-),女,陜西西安人,高級(jí)獸醫(yī)師,碩士,主要從事動(dòng)物疫病檢測(cè)和防控工作。