艾地云,姚 琪,羅 玲,邵華斌,楊 峻,楊前平,王紅琳,溫國元,羅青平,張蓉蓉

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430064;

2.武漢理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,湖北武漢 430070)

湖北部分地區(qū)鴨疫里氏桿菌的分離鑒定*

艾地云1,姚 琪2,羅 玲1,邵華斌1,楊 峻1,楊前平1,王紅琳1,溫國元1,羅青平1,張蓉蓉1

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430064;

2.武漢理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,湖北武漢 430070)

對湖北省部分地區(qū)鴨疫里氏桿菌(RA)進(jìn)行分離鑒定。應(yīng)用胰蛋白大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)及染色試驗(yàn)、生化試驗(yàn)、PCR鑒定,得到86株RA。染色觀察各地RA分離株的細(xì)菌形態(tài)一致,符合RA特征;生化試驗(yàn)顯示86株RA的生理生化特征相似,基本符合RA特征;應(yīng)用建立的PCR技術(shù)均可從這些菌株擴(kuò)增到RA的特異性基因片段。通過與陽性血清所做的玻片凝集試驗(yàn),證明分離出的RA菌株全部屬于血清1型。8個(gè)地區(qū)(市)的20個(gè)養(yǎng)鴨場皆分離出RA。經(jīng)統(tǒng)計(jì),腦組織中RA分出率(81/86)明顯高于心血(53/86)及肝組織(49/86);10日齡～21日齡鴨最易感,且鴨感染RA呈明顯的年齡抵抗性;櫻桃谷鴨最易感。在RA陽性病料中同時(shí)分離到28株大腸埃希菌,顯示其與鴨大腸埃希菌混合感染率高達(dá)32.56%。人工感染鴨的致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,RA的致病力較強(qiáng),與大腸埃希菌混合感染的致病力更強(qiáng)。結(jié)果表明鴨疫里氏桿菌病已成為湖北省養(yǎng)鴨業(yè)最常見的、危害最大的細(xì)菌性傳染病之一。

鴨疫里氏桿菌;分離與鑒定;血清型;混合感染;致病性試驗(yàn)

鴨疫里氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎,是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipesti f er,RA)引起的鴨的一種細(xì)菌性傳染病,主要侵害2周齡～8周齡鴨,以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎為主要的病理特征,發(fā)病率 5%～90%,病死率可高達(dá)90%[1-7]。Riemer于1904年最早報(bào)道了鵝感染RA發(fā)病,郭玉璞等于1982年首次報(bào)道我國在北京發(fā)現(xiàn)鴨感染RA發(fā)病,此后在全國各地相繼有該病發(fā)生的報(bào)道[2-7],已報(bào)道的RA有21個(gè)血清型,各地流行的 RA血清型各不相同,以1、2型RA最為多見,而各血清型之間缺乏交叉免疫保護(hù),給應(yīng)用疫苗接種防控該病增加了難度。近年來湖北省規(guī)?；B(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展迅猛,鴨傳染性漿膜炎的病死率高達(dá)10%～30%,給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)鴨業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。為了摸清該病在湖北省的危害情況和發(fā)生規(guī)律,確定當(dāng)?shù)豏A流行株的血清型等,開展了本調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2008年3月～2009年3月間,在湖北省武漢、黃岡、黃石、荊門、荊州、咸寧、仙桃、天門、潛江9個(gè)主要養(yǎng)鴨地區(qū)(市)21個(gè)規(guī)?；唸?收集的具有典型傳染性漿膜炎病變的死鴨或同群病鴨196羽,其品種有櫻桃谷肉鴨、櫻桃谷種鴨、漢南1號(hào)蛋鴨、地方麻鴨肉鴨、地方麻鴨蛋鴨,日齡范圍為10日齡～42日齡。

1.1.2 培養(yǎng)基 Tryptic Soy Agar(TSA)為Difco公司產(chǎn)品;麥康凱瓊脂、小牛血清(FCS)為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品。TSA瓊脂(含50 g/L FCS)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基按各自使用說明書自行制備。

1.1.3 細(xì)菌微量生化反應(yīng)管 杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 分型血清 1、2、5、7、9型 RA 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院蘇敬良教授及揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院朱國祥教授惠贈(zèng)。

1.1.5 核酸提取試劑盒和PCR引物 試劑盒為上海華舜生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;PCR引物序列參照文 獻(xiàn) [8],上 游 引 物 5′-CAGCT TAACTGTAGAACTGC-3′,下游引物 5′-TCGAGAT TTGCATCACT TCG-3′,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.6 試驗(yàn)用動(dòng)物 1日齡健康櫻桃谷鴨為武漢市黃陂某種鴨場孵化,飼養(yǎng)14 d,期間不進(jìn)行疫苗免疫,無任何發(fā)病癥狀。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與鑒定

1.2.1.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無菌采集病、死鴨的腦、心血、肝并劃線接種到TSA(含 50 g/L FCS)培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基,將 TSA培養(yǎng)基置于燭缸內(nèi),然后與麥康凱培養(yǎng)基一起置37℃培養(yǎng)24 h,觀察細(xì)菌的生長情況。

挑取在 TSA培養(yǎng)基上呈圓形凸起、邊緣整齊、半透明、有光澤、成奶油狀,直徑為 0.5 mm～1.5 mm、用折射光觀察可見微弱虹光的單個(gè)菌落,同時(shí)劃線接種于TSA(含50 g/L FCS)及麥康凱培養(yǎng)基,同上37℃培養(yǎng)24 h。在麥康凱培養(yǎng)基上不生長的菌落為可疑 RA,在TSA(含50 g/L FCS)培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)此菌,待進(jìn)一步鑒定。

在麥康凱培養(yǎng)基上生長的紅色菌落為可疑大腸埃希菌(Escherichia coli),大腸埃希菌的純化、鑒定及O型血清型鑒定參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.1.2 細(xì)菌形態(tài)觀察 挑取少許分離菌純培養(yǎng)物涂片、進(jìn)行革蘭染色及瑞特染色,鏡檢。

1.2.1.3 細(xì)菌生化試驗(yàn) 選擇氧化酶、酶觸、明膠、H2S、山梨醇、衛(wèi)矛醇、肌醇、木糖、棉子糖、阿拉伯糖、葡萄糖、蔗糖、尿素酶、枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原微量生化反應(yīng)管進(jìn)行試驗(yàn)。用無菌生理鹽水將分離菌純培養(yǎng)物洗下并制成懸液,分別接種于各微量生化反應(yīng)管,37℃放置(除明膠置20℃室溫之外)48 h,觀察結(jié)果。

1.2.1.4 RA PCR鑒定 參照文獻(xiàn)[8,10-12]的方法,以分離菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物擴(kuò)增的目的條帶大小為662 bp。反應(yīng)體系(50 μL):10 ×reaction buffer 5 μL,上下游引物 各20 pmol,dNTP各10 nmol,Taq酶2.5 U,模板1 μL,加水補(bǔ)足至 50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序:94℃5min;94℃50 s,55℃50 s,72℃1 min,30個(gè)循環(huán);72℃7 min。對擴(kuò)增的16 S rRNA基因片段純化產(chǎn)物進(jìn)行測序分析,PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2.1.5 RA血清型鑒定 采用玻片凝集法進(jìn)行。于無菌載玻片上滴無菌生理鹽水1滴,用接種環(huán)沾取待檢菌純培養(yǎng)物少許,與生理鹽水混勻,滴加未稀釋的陽性血清1滴,混勻,室溫靜置,3min內(nèi)判定結(jié)果,以大腸埃希菌、生理鹽水作陰性對照。3min內(nèi),出現(xiàn)清晰的乳白色顆粒狀凝集為陽性,不出現(xiàn)者為陰性。

1.2.2 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 選擇具有代表性的分離株(20株RA、15株E.coli,即每個(gè)鴨場各選1株)純培養(yǎng)物,用滅菌生理鹽水將所有分離菌的菌落洗下,用平均計(jì)數(shù)法調(diào)整活菌濃度,制成RA懸液(含RA約1×109cfu/mL)、E.coli懸液(含E.coli約5×1010cfu/mL)和 RA+E.coli混合懸液(含RA 約 1×109cfu/mL、E.coli約5×1010cfu/mL)。將32只14日齡健康櫻桃谷鴨分為4個(gè)組,其中3個(gè)試驗(yàn)組、1個(gè)對照組,8只/組。試驗(yàn)1組每只腹腔注射0.5 mLRA懸液,試驗(yàn)2組每只腹腔注射0.5 mLE.coli懸液,試驗(yàn)3組每只腹腔注射0.5 mL RA+E.coli混合懸液,對照組每只腹腔注射0.5 mL滅菌生理鹽水。分開飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件相同,觀察14 d,對所有試驗(yàn)鴨進(jìn)行剖檢并分離鑒定病原菌。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離結(jié)果

從196羽具有傳染性漿膜炎病變的病、死鴨的腦、心血和肝中共分離出86株RA,其中武漢、荊州、黃岡、黃石、荊門、咸寧、仙桃、天門、潛江分別分離出21 、9、5、0、8、10、7、8、18 株,分出率為43.88%。其中從腦組織中分離出81株,分出率為94.19%;從心血中分離出53株,分出率為61.63%;從肝臟組織中分離出49株,分出率為56.98%。從RA陽性病料中分離出28株大腸埃希菌,鴨RA與E.coli的混合感染率為32.56%。湖北省9個(gè)地市21個(gè)養(yǎng)鴨場有8個(gè)地市20個(gè)養(yǎng)鴨場分離出RA。從10日齡～42日齡病、死鴨中皆分離出RA,其中10日齡～21日齡分離數(shù)量最多,占總數(shù)的87.21%;從各品種病、死鴨中皆分離出 RA,其中櫻桃谷肉鴨分離數(shù)量最多(表1～表2)。

表1 各日齡病、死鴨RA分離情況Table 1 The results of the RA strains isolated from ducks in different day s of age

2.2 RA的鑒定結(jié)果

2.2.1 RA的形態(tài)鑒定結(jié)果 86株RA分離株均呈革蘭陰性、不運(yùn)動(dòng)、無芽胞、單個(gè)或成雙存在、偶見有長絲狀的短小桿菌,瑞特染色呈兩極濃染,符合RA的形態(tài)特征。

2.2.2 RA的生化鑒定結(jié)果 86株RA分離株的生化鑒定結(jié)果見表3。結(jié)果顯示氧化酶、觸酶、明膠皆為陽性反應(yīng);葡萄糖(5/86)、蔗糖(5/86)、硝酸鹽還原(4/86)約5%為陽性反應(yīng),約95%為陰性反應(yīng);木糖、肌醇、衛(wèi)茅醇、硫化氫、檸檬酸鹽皆為陰性反應(yīng),基本符合RA的生化特性。

2.2.3 RA的PCR鑒定結(jié)果 86株 RA分離株的16 S rRNA基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陽性,部分RA分離株的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。PCR擴(kuò)增的基因片段大小約為662 bp,基因片段測序結(jié)果經(jīng)NCBI blast比對,分離菌株的基因片段序列與鴨疫里氏桿菌的16 S rRNA基因同源性達(dá)98%以上。

2.2.4 RA的血清學(xué)鑒定結(jié)果 所有RA分離株與RA1型陽性血清的玻片凝集反應(yīng)均呈陽性,與其他型標(biāo)準(zhǔn)血清的玻片凝集反應(yīng)均呈陰性,表明86株RA均屬血清1型。

2.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)鴨在人工感染分離菌后12 h,試驗(yàn)組鴨開始出現(xiàn)精神沉郁,行動(dòng)遲緩,排綠色稀糞,共濟(jì)失調(diào)。人工感染RA+E.coli后24 h,試驗(yàn)3組鴨全部死亡,死亡率為100%;人工感染RA后36 h試驗(yàn)1組鴨死亡7只、發(fā)病 1只,死亡率為87.50%,病死率為100%;人工感染E.coli后36 h試驗(yàn)2組鴨死亡4只、發(fā)病3只,死亡率為50.00%,病死率為87.50%;至第14天,試驗(yàn)組再無鴨死亡,對照組鴨無任何癥狀、無死亡。剖檢可見試驗(yàn)組死鴨心包積液渾濁,心包膜增厚、氣囊壁增厚、肝腫大、腦腫大,呈急性鴨疫里氏桿菌病及大腸桿菌病病理特征;試驗(yàn)組發(fā)病鴨有典型的纖維素性＂三炎＂特征;對照組鴨正常。無菌取試驗(yàn)鴨腦組織進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)及鑒定,結(jié)果從試驗(yàn)1組鴨腦中分離到RA,從試驗(yàn)2組鴨腦中分離到E.coli,從試驗(yàn)3組鴨腦中分離到RA及E.coli,而對照組鴨腦中沒有分離出RA和E.coli,說明試驗(yàn)組鴨發(fā)病、死亡皆由人工感染所致。

表2 各品種病、死鴨RA分離情況Table 2 The results of the RA strains isolated from ducks in different variety duck

表3 86株RA分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of biochemical tests of 86 RA strains

圖1 21株鴨疫里氏桿菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR results of 21 RA strains

3 討論

從收集的196羽具有傳染性漿膜炎病變的病、死鴨中分離到86株RA,分離率為43.88%。調(diào)查了湖北省9個(gè)地市21個(gè)鴨場,其中有8個(gè)地市20個(gè)養(yǎng)鴨場均分離出RA。說明鴨疫里氏桿菌病已成為該省引起鴨發(fā)病、死亡最主要的細(xì)菌性疾病,其中有1個(gè)市未分離到RA,可能是新鴨場的緣故。在RA陽性病料中同時(shí)分離到28株大腸埃希菌。說明該地區(qū)鴨疫里氏桿菌病以RA單一感染為主(感染率為67.44%)、與鴨E.coli混合感染情況(感染率為32.56%)較為嚴(yán)重,據(jù)楊宗維等[7]報(bào)道南寧市RA與E.coli混合感染率為31.08%,言天久等[5]報(bào)道百色市 RA與E.coli混合感染率高達(dá)56.45%,說明我國各地鴨場 RA與E.coli混合感染普遍存在,所以在進(jìn)行鴨疫里氏桿菌病的防控時(shí),應(yīng)同時(shí)考慮鴨大腸桿菌病,才能取得好的預(yù)期效果。

血清型鑒定86株RA全部屬于血清1型,說明目前湖北省流行的RA以血清1型為主。鴨疫里氏桿菌有21個(gè)血清型,據(jù)報(bào)道我國流行的主要有1、2、3、6、7、10、11、13、14 等,1、2 最為廣泛流行 ,且各個(gè)血清型間的交叉保護(hù)性不強(qiáng)[12-15],提示湖北省應(yīng)該用1型鴨疫里氏桿菌病疫苗接種預(yù)防該病。

研究結(jié)果表明RA對鴨的感染日齡主要分布在10日齡～42日齡。由于1周齡鴨體內(nèi)母源抗體可提供足夠的保護(hù)力,幾乎不發(fā)生該病。10日齡～21日齡鴨感染率最高(占87.21%)。在10日齡～42日齡范圍內(nèi),鴨對RA感染呈明顯年齡抵抗力。結(jié)果還顯示櫻桃谷鴨對RA最易感、其次為地方麻鴨、漢南1號(hào)蛋鴨。與言天久等[5]報(bào)道2周齡～5周齡雛鴨最易感,北京鴨相比櫻桃谷鴨、靖西大麻鴨、西林麻鴨、番鴨最易感;楊宗維等[7]報(bào)道2周齡～6周齡肉鴨對RA的感染表現(xiàn)出明顯的年齡抵抗力結(jié)果相似。

從不同地區(qū)分離出的86株RA的菌落形態(tài)、細(xì)菌形態(tài)一致,其生理生化特征基本一致,但約有5%的菌株對葡萄糖(5/86)、蔗糖(5/86)、硝酸鹽還原(4/86)反應(yīng)為陽性是例外。據(jù)馮金牛等[11]報(bào)道RA分離株氧化酶陽性率約83.30%,明膠陽性率為50%;楊宗維等[7]報(bào)道RA分離株果糖發(fā)酵陽性率約5.41%,氧化酶陽性率約81.08%,明膠液化陽性率約41.89%;李婧等[14]報(bào)道 RA分離株對各種糖、氨基酸、明膠的生化試驗(yàn)結(jié)果不盡相同。但RA硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性反應(yīng)尚未見報(bào)道,原因有待查明。

分離菌株人工感染14日齡雛鴨時(shí),RA單獨(dú)感染時(shí)毒力很強(qiáng),鴨病死率為100%;RA與E.coli混合感染時(shí)毒力更強(qiáng),死亡率為 100%。與言天久等[5]報(bào)道RA單獨(dú)感染的發(fā)病率87.5%、死亡率71.4%,RA與E.coli混合感染發(fā)病率100%、死亡率75%的結(jié)果較為一致。表明該研究RA分離株為有較強(qiáng)毒力的菌株,可用作制備疫苗的備選菌株。

[1]Saif Y M.禽病學(xué)[M].11版.蘇敬良,高 福,索 勛,譯.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005:767-772.

[2]劉傳華,趙艷麗,王玉海,等.鴨疫里默氏菌研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(5):91-93.

[3]黃承洪,李繼祥,黃 偉,等.重慶和四川地區(qū)鴨疫里默氏桿菌流行動(dòng)態(tài)研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29(1):67-70.

[4]吳彩艷,覃宗華,袁建豐,等.廣東地區(qū)鴨疫里氏桿菌的血清型及抗藥性情況調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī),2009,41(5):22-25.

[5]言天久,韋 平,潘 懿,等.百色市鴨疫里默氏桿菌病的流行病學(xué)及其病原的分離與鑒定[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2007,26(4):298-308.

[6]謝永平,陳澤祥,許力干,等.鴨疫里氏桿菌油乳劑三價(jià)滅活疫苗的研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,31(7):45-48.

[7]楊宗維,韋 平,周 祥,等.南寧市商業(yè)肉鴨鴨疫里默氏桿菌病的調(diào)查研究[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2006,25(3):210-213.

[8]Tsai H J,Liu Y T,Tseng C S,et al.Genetic variation of the ompA and 16S rRN A genes ofRiemerella anatipesti fer[J].Avian Pathol,2005,34(1):55-64.

[9]羅 玲,艾地云,楊 峻,等.湖北省部分地區(qū)鴨致病性大腸桿菌的分離與血清型鑒定[J].中國家禽,2009,31(8):44-45.

[10]Christensen H,Bisgaard M.Phylogenetic relationships ofRiemerella anatipestif erserovars and related taxa and an evaluation of specific PCR tests reported forR.anatipesti fer[J].J Appl Microbiol,2010,108(5):1612-1619.

[11]馮金牛,阮二壘,楊麗云,等.鴨疫里氏桿菌的分離與 16 S rRNA的鑒定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,31(6):73-76.

[12]林樹乾,張 燕,于可響,等.鴨疫里默氏桿菌PCR快速檢測方法的建立與應(yīng)用[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(8):107-110.

[13]張大丙,曲豐發(fā),鄭獻(xiàn)進(jìn).鴨疫里默氏菌血清型的研究概況[J].中國獸醫(yī)雜志,2006,42(11):38-40.

[14]李 婧,朱瑞良,李 舫,等.山東地區(qū)3型鴨疫里氏桿菌的分離鑒定及主要生物學(xué)特性研究[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2009,17(3):49-54.

[15]孫英峰,李秀麗.鴨疫里默氏桿菌生物學(xué)特性研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī),2008,35(12):130-132.

Isolation and Identification ofRiemerella anatipesti ferin Some Areas of Hubei Province

AI Di-yun1,YAO Qi2,LUO Ling1,SHAO Hua-bin1,YANG Jun1,YANG Qian-ping1,WANG Hong-lin1,WEN Guo-yuan1,LUO Qing-ping1,ZHANG Rong-rong1

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding,Wuhan,Hubei,430064,China;2.School of Natural Resources and Environmental Engineering,Wuhan University of Technology,Wuhan,Hubei,430070,China)

Riemerella anatipesti fer(RA)was identified from duck farms in Hubei.The bacteria were identified as RA by the Gram stain test,biochemical reaction and PCR amplifications of the outer membrane gene.Each RA strain originated from different districts had identical morphology,approximate biochemical characteristics and Specific gene fragment of RA was amplified.Slide agglutination test demonstrated that all the RA isolates belong to serotype 1.The RA isolates was isolated on 20 duck farms with different variety ducks in 8 counties of Hubei.The isolation rate of brain(81/86)was significant higher than that of heart blood(53/86)and liver(49/86).Ducklings of 10 day-old to 21 day-old and Cherry valley ducks were more susceptive than that of others to RA infection.A significant age resistance against RA infection was observed during the period of 10 day-old to 42 day-old.28Escherichia coliwere isolated concurrently from the RA positive ducks,and with a 32.56%co-infection rate.Challenge test showed that RA is virulent and even more virulent when co-infected withE.coli.The results showed that RA infection was one of the most common causes for the losses in duck industry.

Riemerella anatipesti fer;isolation and identification;serotype;co-infection;pathogenicity test

S858.32

A

1007-5038(2011)09-0046-05

2011-03-29

湖北省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA201E02);湖北省科技計(jì)劃研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2009BBB003)

艾地云(1962-),女,湖北隨縣人,副研究員,碩士,主要從事家禽傳染病綜合防控研究