屈素潔,鄭 敏,梁 媛,莫勝蘭,陸文俊,粟艷瓊,胡 杰,李 軍,劉 棋

(廣西動物疫病預防控制中心,廣西南寧 530001)

2株H3N8亞型禽流感病毒HA和NA基因遺傳變異分析

屈素潔,鄭 敏,梁 媛,莫勝蘭,陸文俊,粟艷瓊,胡 杰,李 軍,劉 棋*

(廣西動物疫病預防控制中心,廣西南寧 530001)

采用RT-PCR技術擴增了2株H3N8亞型流感毒株A/duck/Guangxi/69/2009和A/chicken/Guangxi/2117/2010的HA和NA基因,并與GenBank中收錄的其他毒株序列進行比較分析和遺傳進化分析。結果表明,分離株的HA與NA基因全長分別為1 733 bp、1 432 bp。A/duck/Guangxi/69/2009株的HA基因與A/duck/Siberia/100/01株的相似性最高,A/chicken/Guangxi/2117/2010株的HA基因與A/white munia/HongKong/4519/00株的相似性最高;而 A/duck/Guangxi/69/2009株的 NA基因與A/duck/Eastern China/91/09株的相似性最高,A/chicken/Guangxi/2117/2010株的 NA基因與A/aquatic bird/Korea/KN-1/04株的相似性最高。2株H3N8禽流感病毒位于同一分支,同源關系較近。2株H3N8禽流感病毒的HA推導的氨基酸剪切位點序列均為P-E-K-Q-T-R,為典型低致病性禽流感病毒的特征序列。

禽流感病毒;HA基因;NA基因;序列分析

*通訊作者

禽流感(Avian influenza,AI)是由正黏病毒科A型流感病毒屬流感病毒引起的一種禽類烈性傳染病,不僅對養(yǎng)禽業(yè)危害嚴重,而且嚴重威脅人類健康[1]。根據(jù)禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)粒子表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)的抗原性的不同,目前將其分為 16個HA亞型和9個NA亞型[2-3]。抗原漂移(antigenic drift)和抗原轉變(antigenic shift)導致AIV變異頻繁,同一血清型的各亞型間基因序列差異較大,即使同一亞型內核苷酸序列也有差異。

野生水禽是流感病毒的基因儲存庫和新毒株的重要來源,已知全部16種HA亞型和9種NA亞型AIV均可從水禽分離到[4],說明水禽在流感病毒的進化和生態(tài)分布中具有重要作用。目前我國家禽飼養(yǎng)量大、范圍廣,廣大農(nóng)村主要是粗放型養(yǎng)殖,自由散養(yǎng)的鴨、雞和野禽?；煸谝黄?并共用同一水源,這為AIV的傳播創(chuàng)造便利條件[5-6]。對家禽進行長期的AIV分子流行病學監(jiān)測,密切關注其傳播和進化情況,具有重要的公共衛(wèi)生學的意義。本研究對市場監(jiān)測中分離到的2株H3N8亞型AIV的HA和NA基因序列進行序列測定,分別與GenBank選取的國內外H3亞型及N8亞型禽流感病毒代表株進行同源性比較,分析其遺傳進化關系。旨在從分子生物學角度了解H3N8亞型AIV在廣西的遺傳變異情況,為禽流感的防控提供基礎信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和試劑 禽流感病毒A/duck/Guangxi/69/2009和A/chicken/Guangxi/2117/2010由廣西動物疫病預防控制中心分離鑒定和保存;T rizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品;AMV逆轉錄酶及相關試劑、TaqDNA聚合酶、Agarose Gel DNA Purification Kit、pMD-18T載體等,均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 引物 依據(jù)GenBank上發(fā)表的H3N8亞型AIV HA和NA基因片段兩端核苷酸保守序列采用Primer6.0軟件分別設計出2對引物,HA基因引 物 為 HA-U:5′-AGCAAAAGCAGGGGATACTT-′3,HA-L:5′-AGGTGCAACATT TGCAT TTGAGTA-′3,預 期擴增 HA 基因 片段為1733bp。NA 基 因 引物 為 NA-U:5′-TGTATCAAAAGCCGGAGTT-′ 3,NA-L:5′-CT TCCCT TTGACATCGATAAAGG-′3,預期擴增 NA基因片段為1 432 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。反轉錄引物為通用引物Un12:5′-AGCAAAAGCAGG-′3

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取 取250 μL病毒尿囊液 ,加入 750 μL Trizol試劑,混勻后室溫靜置 5 min,加入200 μL氯仿,輕微振蕩混勻,4 ℃12 000 r/min離心 10 min,取上清約 500 μL,加入 0.5 mL異丙醇,混勻后室溫靜置10 min,12 000 r/min離心10 min,沉淀干燥后懸于適量的DEPC處理水中備用。

1.2.2 RT-PCR 取病毒 RNA 懸液 15 μL,與反轉錄引物(流感病毒通用引物)1 μL(20 pmol/μL)混合,加入 AMV 逆轉錄酶 5×buffer 5 μL、dNTP(10 mmol/L)2 μL 、RNasin 1 μL(20 U)、AMV 逆轉錄酶1 μL(5 U),加DEPC處理水補總體積 25 μL?；旌衔镏糜?2℃作用60 min。PCR反應體系為10×Taq聚合酶緩沖液 5 μL,dNTPs(10 mmol/L)2 μL,上、下游引物(20 pmol/μL)各 1 μL,cDNA 2.5 μL,TaqDNA 聚合酶 1 μL(5 U),用無菌水補足至50 μL。PCR反應條件:95℃,2 min;94℃,45 s,55℃,45 s,72℃,2 min,35個循環(huán);72℃ ,10 min。取PCR產(chǎn)物6 μL在10 g/L瓊脂凝膠上電泳檢查結果。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收、克隆和序列測定 PCR產(chǎn)物用Agarose Gel DNA Purification Kit回收后,與pMD-18T載體連接、轉化,藍白斑篩選重組質粒并用PCR鑒定。每個樣品挑取陽性克隆,由寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定。

1.2.4 同源性分析和進化樹構建 應用DNA Star軟件對測序基因片段進行拼接和氨基酸序列推導,利用GenBank中的BLAST軟件查找核苷酸和氨基酸的同源序列,應用ClustalX1.83軟件進行序列比對并用MEGA3.1軟件繪制遺傳進化樹。

2 結果

2.1 HA和NA基因擴增

經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,擴增到的HA基因片段長約1.7 kb,擴增到的NA基因片段長約1.4 kb,兩個基因的擴增結果與預期擴增長度一致(圖1)。

圖1 HA和NA基因擴增結果Fig.1 PCR amplification results of HA gene and NA gene

2.2 HA和NA基因核苷酸序列與氨基酸分析

序列測定結果已經(jīng)登錄到GenBank,登錄號分別 為 HQ647010、HQ874606、HQ647011 和HQ874607。測序結果表明,所擴增的 HA基因編碼區(qū)均由1 701個核苷酸組成,編碼567個氨基酸,不存在核苷酸缺失。整個編碼區(qū)含有18個保守的半肌氨酸(Cys),具有H3亞型AIV的6個保守的潛在糖基化位點,5個在 HA1區(qū)(位于第22/24、38、54、181、301位氨基酸),1個在HA2區(qū)(第 499位氨基酸),在144和145位氨基酸處(以 H3的ORF計)不存在香港近年陸生家禽分離株的天冬氨酸殘基(Aspartic acid)的插入[7]。推導氨基酸序列分析結果表明,2株H3N8廣西分離株在HA裂解位點處均只含有1個堿性氨基酸,具有典型的低致病性AIV株特征。

所擴增的NA基因編碼區(qū)均由1 413個核苷酸組成,編碼471個氨基酸,不存在核苷酸缺失。在整個蛋白質氨基酸序列中,預測共有6個潛在的糖基化位點。與其他毒株的NA一樣,在相似的位置上共有17個半胱氨酸殘基,維持NA蛋白分子空間構象的半胱氨酸殘基基本保守,一些具有重要功能的結構域的氨基酸殘基也高度保守。這些都說明蛋白質維持其空間構象所必要的氨基酸位點是相對穩(wěn)定的,其他有差異的氨基酸位點是禽流感病毒亞型多樣性的具體表現(xiàn)。

2.3 HA和NA基因同源性及遺傳進化分析

將本試驗的測序結果與國內外具代表性的同亞型分離株進行比較,結果表明,2株廣西分離毒株HA基因核苷酸序列同源性89.4%,氨基酸序列同源性為95.4%。廣西分離株與參考毒株HA基因的核苷酸序列同源性為82.8%～98.8%,氨基酸序列同源性為92.4%～98.4%。A/duck/Guangxi/69/2009與A/duck/Siberia/100/01和A/aquatic bird/Hong Kong/399/99的核苷酸序列同源性最高,分別為94.6%和94.1%。A/chicken/Guangxi/2117/2010與A/white munia/Hong Kong/4519/00的核苷酸序列同源性最高,為97%。

2毒株NA基因核苷酸序列同源性89.3%,氨基酸序列同源性為93.8%。廣西分離株與參考毒株HA基因的核苷酸序列同源性為 77.2%～97.9%,氨基酸序列同源性為84.7%～98.2%。A/duck/Guangxi/69/2009與A/duck/Eastern China/91/09的核苷酸序列同源性最高,為97.9%。A/chicken/Guangxi/2117/2010與A/aquatic bird/Korea/KN-1/04的核苷酸序列同源性最高,為95.5%。

2個毒株的HA基因、NA基因與GenBank中相應流感基因片段的遺傳進化關系見圖2和圖3。

圖2 HA基因遺傳進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of HA gene

從圖2可見,A/duck/Guangxi/69/2009HA基因與2001年俄羅斯鴨源毒株A/duck/Siberia/100/01及1999年香港分離的水禽源毒株A/aquatic bird/Hong Kong/399/99的親緣關系最近,它們可能來源于同一祖代毒株,而A/chicken/Guangxi/2117/2010株的HA基因與A/white munia/Hong Kong/4519/00株的親緣關系最近,并且它們處于同一分支,由共同祖先演化而來。

從圖3可以看出,N8基因分為2個亞系。A/duck/Guangxi/69/2009 NA基因與2000年中國東部鴨分離株A/duck/Eastern China/91/09親緣關系最近,而A/chicken/Guangxi/2117/2010株的NA基因與A/aquatic bird/Korea/KN-1/04株的親緣關系最近。另外,這兩株的NA基因與南昌鴨源A/Duck/Nanchang/1681/92和韓國雞源 A/chicken/Korea/164/04(H9N8)禽流感分離株也有較近的親緣關系,它們可能來源于同一個進化組群。

圖3 NA基因遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of NA gene

3 討論

禽流感病毒的血凝素(HA)蛋白在感染過程中被水解為HA1和HA2兩條肽鏈,是病毒感染細胞的先決條件;另外,HA的變異性很強,是病毒發(fā)生抗原變異的主要原因;HA還是病毒毒力和宿主特異性的主要決定因素[8-10]。大多數(shù)高致病力毒株的HA在其裂解位點附近有多個堿性氨基酸插入,在無類胰蛋白酶的情況下就能發(fā)生裂解,造成感染禽全身系統(tǒng)衰竭,導致死亡。低致病力毒株的HA在其裂解位點附近通常只有1個或沒有堿性氨基酸,故只能被有限的細胞內蛋白酶所識別,造成溫和感染或不表現(xiàn)臨床癥狀[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)2個H3N8廣西分離毒株HA裂解位點的氨基酸序列均為P-EK-Q-T-R,符合低致病性禽流感裂解位點的氨基酸序列特征。

HA上潛在的糖基化位點是影響AIV毒力的因素之一。受體結合位點的裂解位點附近的糖基化位點可能影響到蛋白酶對HA前體蛋白的裂解,裂解位點糖基會影響AIV和宿主細胞的結合水平[13]。附近糖鏈的存在干擾了泛素蛋白酶進入裂解位點。對這2份分離株HA基因潛在的糖基化位點進行了分析,結果發(fā)現(xiàn)6個潛在的糖基化位點均較為保守,未出現(xiàn)缺失現(xiàn)象。除了A/chicken/Guangxi/2117/2010第24位發(fā)生變異以外,在其余各糖基化位點均未發(fā)生變異,糖基化位點相對比較保守。

從HA和NA基因進化樹上看,A/duck/Guangxi/69/2009和A/chicken/Guangxi/2117/2010株處于同一個較大的分支內,同源關系較近。此2株是本實驗室在2009年—2010年期間分別在廣西兩個不同地區(qū)的活禽市場分離到的毒株,地緣關系較遠。出現(xiàn)以上結果說明這兩株毒株可能來源于同一個祖先,只是在傳播的過程中發(fā)生了一定的變異。

分離毒株的HA基因與西伯利亞和香港分離株A/duck/Siberia/100/01和A/aquatic bird/Hong Kong/399/99同源性較高;NA基因與韓國分離株A/aquatic bird/Korea/KN-1/04同源性較高。所以,我們有理由相信分離病毒或其HA和NA片段最初是由其他地區(qū)的野鳥等禽類傳入廣西家禽的,所以必須引起高度重視。

H3N8亞型AIV致病力較低,其在流行病學中的作用常被忽視。流感病毒基因組分節(jié)段的特性使得基因重排成為其快速變異的重要機制之一,許多研究表明,LPAIV可以通過基因重排為感染人類的流感病毒或禽流感病毒提供基因來源。因此,在加強對高致病性禽流感監(jiān)測和研究的同時,也必須要對LPAIV的遺傳進化情況給予足夠重視,加強對低致病性禽流感發(fā)生流行的風險評估。

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Genetic Variation Analysis of HA and NA Genes of Two Isolates of Avian Influenza Virus Subtype H3N8

QU Su-jie,ZHENG Min,LIANG Yuan,MO Sheng-lan,LU Wen-jun,SU Yan-qiong,HU Jie,LI Jun,LIU Qi

(Guangxi Center for Animal Disease Control and Prevention,Nanning,Guangxi,530001,China)

The HA and NA genes of two H3N8 subtype avian influenza viruses A/duck/Guangxi/69/2009 and A/chicken/Guangxi/2117/2010 were amplified by RT-PCR and then sequenced.Nucleotide sequences of the HA and NA gene of the two isolates were 1 733 bp and 1 432 bp in length,respectively.T he results of the comparative sequence analysis showed that the A/duck/Guangxi/69/2009 shared high identity with A/duck/Siberia/100/01,and A/chicken/Guangxi/2117/2010 shared high identity with A/white munia/Hong Kong/4519/00 in HA gene,A/duck/Guangxi/69/2009 shared high identity with A/duck/Eastern China/91/09,and A/chicken/Guangxi/2117/2010 shared high identity with A/aquatic bird/Korea/KN-1/04 in NA gene.The phylogenetic analysis results showed the two H3N8 subtype avian influenza viruses were located in the same phylogenetic branch.The sequence on cleavage site of HA proteins of two H3N8 isolates were both P-E-K-Q-T-R,so these two viruses belonged to low pathogenic avian influenza viruses.

Avian influenza virus;HA gene;NA gene;sequence analysis

S852.659.5;Q785

A

1007-5038(2011)09-0041-05

2011-04-08

國家科技重大專項子課題(2009ZX10004-214)

屈素潔(1982-),女(壯族),廣西南寧人,碩士研究生,主要從事畜禽傳染病學及分子病毒學研究。