劉素英,王晶鈺,董 睿,王利勤,王 慧

(西北農林科技大學動物醫(yī)學院 陜西楊陵 712100)

雞傷寒沙門菌的分離鑒定及藥敏試驗

劉素英,王晶鈺*,董 睿,王利勤,王 慧

(西北農林科技大學動物醫(yī)學院 陜西楊陵 712100)

為給雞傷寒沙門菌病的防控提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)參考,采集疑似雞傷寒病死雞的肝、脾病料,進行細菌分離。根據(jù)細菌形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化試驗等鑒定出13株沙門菌。對分離到的菌株進行21種常用抗菌藥物的敏感性試驗,結果顯示,分離株對阿米卡星、新霉素高度敏感,對卡那霉素、痢特靈中度敏感,而對其他藥物則表現(xiàn)為耐藥。將篩選出的阿米卡星對發(fā)病雞場后續(xù)發(fā)病雞群采用肌肉注射和硫酸新霉素飲水治療和痢特靈拌料飼喂,用藥5 d后,雞群雞傷寒沙門菌病的發(fā)病率從50%降到了5%左右。

傷寒沙門菌;分離鑒定;藥敏試驗;雞

*通訊作者

沙門菌屬(Salmonella)是一群寄生于人和動物腸道內的無芽胞桿菌,是一大屬血清學相關的革蘭陰性桿菌[1-3]。引起禽類發(fā)病的沙門菌主要有雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌及其他有鞭毛能運動的多種沙門菌[2-4]。禽沙門菌病(Avian Salmonellosis)是由多種沙門菌引起的一類傳染病的總稱,臨床上多表現(xiàn)為敗血癥和腸炎[5-6]。沙門菌病能導致禽的生產性能下降,種蛋的孵化率降低,對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經濟損失[7]。我國目前控制該病的主要措施是檢疫淘汰帶菌雞,凈化培育雞群;對于一些沒有條件凈化或短期內還無法凈化的雞群則采用抗菌藥物進行預防和治療,但是由于抗菌藥物的不合理使用,在抗生素的選擇性壓力下使得沙門菌產生的耐藥性越來越快,耐藥譜越來越廣[5-7],因此,在目前還沒有有效免疫制劑的情況下,敏感而有效的抗菌藥物的篩選對該病的防控具有一定的實際意義[8]。本研究對陜西富平縣發(fā)生的一起雞沙門菌病進行了病原分離鑒定以及藥敏試驗,篩選出敏感的藥物用于治療,取得明顯效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采自陜西省富平縣某雞場發(fā)病雞的肝、脾組織。

1.1.2 培養(yǎng)基及微量生化發(fā)酵管 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,伊紅美藍營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,MH肉湯,均為北京奧博星生物技術有限公司產品;微量發(fā)酵管,杭州天和微生物試劑有限公司產品。

1.1.3 藥敏紙片 慶大霉素,批號:090402;菌必治,批號:090410;鏈霉素,批號:090327;卡那霉素,批號:090327;阿米卡星,批號:090306;強力霉素,批號:090220;頭孢拉定,批號:081011;氧氟沙星,批號:090112;環(huán)丙沙星,批號:081212;阿莫西林,批號:090402;頭孢氨芐,批號:090203;新霉素,批號:080708;先鋒 V,批號:090303;先鋒必,批號:080923;羧芐青霉素,批號:090309;痢特靈,批號:080905;氨芐青霉素,批號:090315;頭孢噻吩,批號:081201;復方新諾明,批號:081014;四環(huán)素,批號:081008;氟哌酸,批號:090410,均為杭州天和微生物試劑有限公司產品。

1.1.4 試驗用動物及參考菌株 1日齡未免疫雛雞60只,購自非疫區(qū)孵化場;致病性傷寒沙門菌,由西北農林科技大學動物醫(yī)學院預防獸醫(yī)系獸醫(yī)微生物實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離和純化 取無菌采集的肝、脾、腎分別接種于鮮血瓊脂平板上,置37℃溫箱中培養(yǎng)24 h。觀察細菌生長情況及菌落特征。分別挑取不同菌落涂片、革蘭染色、鏡檢,并進行鮮血瓊脂平板劃線純化培養(yǎng)。

1.2.2 細菌的鑒別培養(yǎng)及形態(tài)結構觀察 挑選純化培養(yǎng)的單個菌落,接種于鑒別用培養(yǎng)基麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍瓊脂平板,同時分別接種于普通肉湯中,37℃培養(yǎng)24 h,觀察不同菌的形態(tài)區(qū)別及生長情況。

1.2.3 生化試驗 從分離出的菌株純培養(yǎng)物挑選出疑似沙門菌13株(編號為S1,S2,S3,…,S13),分別接種于靛基質、構椽酸鹽、尿素、硫化氫、衛(wèi)矛醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、賴氨酸、鳥氨酸等鑒定腸桿菌科常用微量發(fā)酵管中及三糖鐵斜面(TSI),置于37℃溫箱中培養(yǎng)72 h,觀察其生化反應特性。

1.2.4 藥敏試驗 以分離菌的肉湯培養(yǎng)物做適當稀釋,按紙片擴散法[9]操作,根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司提供的“紙片法藥敏試驗抑菌環(huán)直徑判斷標準(mm)”進行結果判定。

1.2.5 致病性試驗 取健康雛雞45只,隨機分為15組,每組3只。2個對照組(雞傷寒沙門菌感染組和健康對照組)。試驗組各組每只雛雞皮下接種0.2 mL不同分離菌的肉湯培養(yǎng)物。雞傷寒沙門菌感染對照組每只皮下接種0.2 mL雞傷寒沙門菌肉湯培養(yǎng)物,健康對照組每只皮下接種等量的滅菌生理鹽水。接種后隔離飼養(yǎng),每日觀察并記錄雛雞的精神、食欲、飲水、糞便、運動及死亡情況,記錄 10 d內雛雞的發(fā)病和死亡情況。及時剖檢病死雛雞,觀察其病理變化,并無菌采集死亡雛雞的肝臟,接種SS營養(yǎng)瓊脂平板,并進行涂片、染色鏡檢及生化試驗。

1.2.6 臨床應用 將藥敏試驗篩選出的阿米卡星對發(fā)病雞場后續(xù)發(fā)病雞群采用肌肉注射和硫酸新霉素飲水治療,并于每千克飼料中加痢特靈0.2 g,連續(xù)1周。同時立即對該雞場的發(fā)病雞進行隔離治療,對病情嚴重的應及時深埋處理,加大雞舍內外的消毒次數(shù),立即制定和實施嚴格的衛(wèi)生管理制度,在不同階段,選擇敏感藥物及時投喂,勤掃糞便,并觀察記錄臨床效果。

2 結果

2.1 分離菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征

分離菌在伊紅美藍營養(yǎng)瓊脂平板上生長呈表面光滑、圓形、微凸、邊緣整齊、淡藍色、直徑在1 mm～2 mm的小菌落。在普通瓊脂上形成圓形、稍凸起、灰白色、半透明、光滑、濕潤、邊緣整齊但形態(tài)不一的菌落,麥康凱培養(yǎng)基上長出色透明、光滑的圓形小菌落,培養(yǎng)基不變色。挑取單個菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基上,置37℃溫箱培養(yǎng)24 h,肉湯呈一致混濁,管底有灰白色沉淀物。

選取單個菌落制成涂片,革蘭染色之后,油鏡下觀察,可發(fā)現(xiàn)大量短小、兩端鈍圓、多數(shù)單個存在的革蘭陰性小桿菌,無芽胞,無莢膜,無運動能力。

2.2 生化鑒定

13株分離菌生化試驗,結果見表1。

表1結果表明,分離菌株對麥芽糖均為產酸產氣,葡萄糖產酸產氣或不產氣,不發(fā)酵乳糖、蔗糖;枸櫞酸鹽和靛基質試驗反應為陽性;賴氨酸和鳥氨酸反應為陰性;尿素分解試驗為陰性;MR試驗為陽性;VP試驗為陰性;衛(wèi)矛醇和甘露醇試驗為陰性。在TSI中為產酸、斜面變紅、底層反應呈陽性并產硫化氫(H2S)。結果顯示13株分離菌均符合雞傷寒沙門菌的生化特性[10]。

表1 細菌生化和糖發(fā)酵試驗結果Table 1 The results of biochemical and sugar ferment test of bacteria

2.3 動物致病性試驗

13株分離菌的動物致病性試驗,結果見表2。

表2結果表明,13株分離菌除S2和S11菌株外,均對雛雞有較強的致病性,并且在5 d內出現(xiàn)發(fā)病與死亡,健康對照組雛雞生長良好,而致病性傷寒沙門菌組雛雞全部發(fā)病并死亡。

無菌采取病死雞的肝臟,劃線接種于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上,經37℃培養(yǎng)24h 后,均有無色或琥珀色半透明菌落的菌落生長;取肝組織涂片,革蘭染色檢查,可見紅色的小桿菌,單個或成對存在。

2.4 藥敏試驗

13株分離菌藥敏試驗,結果見表3。表3結果顯示,分離菌對阿米卡星、新霉素高度敏感,敏感率為100%;對痢特靈、卡那霉素中度敏感,敏感率分別為61.5%、53.8%;而復方新諾明、四環(huán)素、先鋒必等藥物則表現(xiàn)為耐藥。

表2 13株分離菌的動物致病性試驗結果Table 2 T he results of animal pathogenicity test of 13 isolates

表3 13株分離菌藥敏試驗情況Table 3 T he results of drug sensitivity test of 13 isolates

2.5 臨床應用

將篩選出的阿米卡星對發(fā)病雞場后續(xù)發(fā)病雞群采用肌肉注射和硫酸新霉素飲水治療和痢特靈拌料飼喂后效果顯著,用藥5 d后,病雞恢復食欲,精神大大好轉,黃綠色稀糞也顯著減少,死亡率顯著降低,整個雞群雞傷寒沙門菌病的發(fā)病率從50%降到了5%左右。再用1周后,發(fā)病率幾乎降為0。

3 討論

在不同的國家和地區(qū),引起沙門菌病流行的血清型不盡相同,即使同一地區(qū)在不同時期,其致病菌株的血清型也會發(fā)生改變,而且在同一養(yǎng)殖場同時可發(fā)生多種血清型混合感染。不同種類的細菌,由于其細胞內新陳代謝的酶系不同,對營養(yǎng)物質的吸收利用、分解排泄及合成產物的產生等都有很大的差別,細菌的生化試驗就是檢測某種細菌能否利用某種(些)物質,及其對某種(些)物質的代謝及合成產物,確定細菌合成和分解代謝產物的特異性,借此來鑒定細菌的種類,所以生化特性是進行細菌鑒定的常規(guī)指標[11-12]。本次分離的雞傷寒沙門菌,在生化特性上與以往報道的不盡相同,例如13株菌均不能發(fā)酵衛(wèi)矛醇,其中有3株菌能發(fā)酵乳糖,表明該菌株在生化特性上與其他地區(qū)的有一定差異性。

雞傷寒沙門菌對許多抗菌藥物敏感,長期以來,藥物防控一直是生產中控制該病的主要措施。但反復多次投藥既增大了養(yǎng)殖成本,且易出現(xiàn)耐藥菌株,給該病的防控帶來了極大的困難[13]。本試驗選用了21種抗菌藥物對所分離到的雞傷寒沙門菌進行了藥敏試驗。結果表明,該地區(qū)雞傷寒沙門菌耐藥現(xiàn)象較嚴重,對菌株敏感的藥物只有阿米卡星、新霉素、痢特靈、卡那霉素等幾種,大多數(shù)藥物呈不敏感或中度敏感,而該場長期應用復方新諾明、四環(huán)素、先鋒必類抗菌藥物,因而分離株對這幾種藥物有強的耐藥性,由此可得出不同地區(qū)用藥習慣不同,導致細菌產生的耐藥性也不同,該結果與張志峰等[14]及徐仕忠等[15]的報道不同。因此,臨床應用藥物防控該病時,必須結合藥敏試驗結果,同時將2種～3種敏感藥物進行交替使用,用藥時一定要按療程和足夠的劑量。但是,消除該病的最根本的辦法仍然是采取全面的飼養(yǎng)管理措施以防止雞白痢或雞傷寒沙門菌傳染給雞群,定期檢疫淘汰帶菌雞,建立無菌雞群,消滅傳染源,切斷垂直傳播鏈鎖,從而徹底消滅雞傷寒沙門菌病。

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Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test of Fowl TyphoidSalmonella

LIU Su-ying,WANG Jing-yu,DONG Rui,WANG Li-qin,WANG Hui

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Y angling,Shaanxi,712100,China)

To provide the theoretic basis and the reference data for the prevention of fowl typhoidSalmonella,60 chicken＇s livers and spleens were collectedin this test.According to the morphology,culture characteristics and biochemical tests of bacteria,13 strains ofSamonellawere identified.The results of drug sensitivity tests showed that theSalmonellaisolates were resistant to paediatric compound sulfamethoxazole tablets,tetracycline tablets,cefoperazone sodium,38%of the strains were resistant to furazolidone and kanamycin,none of the 13 isolates were resistant to amikacin and neomycin.So amikacin were used by intramuscular injection,neomycin were used with water,and furazolidon were used with feed to treat fowl typhoid to chickens.After 5 days,the incidence rate decreased from 50%to 5%.

fowl typhoidSalmonella;islation and identification;drug sensitivity test;chichen

S852.612

A

1007-5038(2011)09-0037-05

2011-05-15

劉素英(1968-),女,陜西南鄭人,碩士研究生,主要從事動物疫病防控研究。