路憲禮,周碧君,2*,王開功,2,文 明,2,程振濤,2,羅 意,江 楠,2

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550025;2.貴州省動(dòng)物疫病研究室,貴州貴陽 550025)

貴州省五個(gè)豬場蚊蠅攜帶PRRSV的調(diào)查*

路憲禮1,周碧君1,2*,王開功1,2,文 明1,2,程振濤1,2,羅 意1,江 楠1,2

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550025;2.貴州省動(dòng)物疫病研究室,貴州貴陽 550025)

為監(jiān)測豬場內(nèi)的蚊蠅是否能攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),采集貴州省5個(gè)養(yǎng)豬場蚊蠅樣本,采用RT-PCR方法引物蚊蠅樣本進(jìn)行PRRSV N基因檢測,對(duì)檢測為陽性樣本的PRRSV-NSP2基因進(jìn)行克隆并測序,最后對(duì)NSP2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示,從花溪、烏當(dāng)、畢節(jié)3個(gè)地方豬場的蚊蠅樣本中均擴(kuò)增出372 bp左右的片段。貴州省蚊蠅樣本的3株P(guān)RRSV-NSP2基因的核苷酸序列之間存在較高的同源性,可達(dá)97.9%～98.3%;蚊蠅樣本的PRRSV-NSP2基因片段與貴州豬場豬源PRRSV流行株相比具有較高的核苷酸同源性,高達(dá)97.6%～100.0%,與國內(nèi)最近流行變異毒株的核苷酸同源性為84.3%～98.8%,而與早期國內(nèi)外分離經(jīng)典毒株的核苷酸同源性為77.1%～97.7%。結(jié)果表明,從貴州省幾個(gè)豬場內(nèi)采集的蚊蠅攜帶PRRSV。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒;蚊蠅;克隆與序列分析

*通訊作者

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗稱豬藍(lán)耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的豬的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為主要特征的傳染病。該病1987年首次在美國暴發(fā)后不到10年時(shí)間幾乎傳遍全世界養(yǎng)豬國家[1]。2006年以后,我國發(fā)生了由PRRSV變異毒株引起的高致病性PRRS疫情,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[2-5]。

豬是PRRSV的自然感染宿主,傳染源有感染豬、公豬精液、污染的用具和車輛等[6],而氣溶膠、家蠅和刺擾伊蚊等可傳播或攜帶該病毒[7]。史開志等[8]報(bào)道貴州省多個(gè)養(yǎng)殖場的三帶喙庫蚊體內(nèi)也能攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒[7-8]。為調(diào)查蚊蠅在傳播PRRSV的生物媒介關(guān)系,本研究對(duì)采集自貴州省部分養(yǎng)豬場蚊蠅樣本進(jìn)行PRSSV攜帶情況和所攜帶毒株變異情況分析,為進(jìn)一步證實(shí)蚊蠅成為豬繁殖與呼吸綜合征病毒的攜帶者提供科學(xué)依據(jù),試驗(yàn)結(jié)果對(duì)防控豬繁殖與呼吸綜合征有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1待檢蚊蠅樣本及陽性對(duì)照 蚊蠅樣本采自貴州省花溪、烏當(dāng)、畢節(jié)、貴陽康寶和六盤水養(yǎng)殖場(蚊蠅種類主要有三帶喙庫蚊、兇小庫蚊、中華按蚊、白紋伊蚊和果蠅等),各場蚊蠅約200只,混合裝于滅菌離心管,低溫裝送至實(shí)驗(yàn)室,置-80℃保存?zhèn)溆?。陽性?duì)照為貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室從貴州某豬場肺組織中分離并保存。

1.1.2 主要試劑 AMV RTase,為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品;RNAiso Reagent、Taq酶等PCR試劑、PstI和EcoR I內(nèi)切酶、pMD-18T載體為寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒,為Omega公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒為博大泰恒公司產(chǎn)品;E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.2 方法

1.2.1 蚊蠅樣本PRRSV陽性篩選 分別取每個(gè)豬場內(nèi)30只蚊蠅樣本先在生理鹽水中漂洗1次～2次,加適量DEPC-H2O于無菌研缽中研磨,勻漿后反復(fù)凍融,12 00 0r/min(4℃)離心10 min,取上清液采用T rizol法提取總 RNA樣本。以針對(duì)PRRSV N 基因 的引 物 (N1:5′-AATATGCCAAATAACAACGG -3′;N2:5′-CTACATGCTGAGGGTGATGC-3′)對(duì)家蠅RNA樣本進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

1.2.2 PRRSV-NSP2基因克隆與測序 取PRRSV-N基因檢測為陽性的豬場蚊蠅每場30只,采用 TrizoL法提取總 RNA樣本,針對(duì) PRRSVNSP2 基因引物(P1:5′-CGATGATGGCTTGAGCTGAGTAT-3′; P2: 5′-GGAGGCACCACGTTGTT TTCAAC-3′)進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增,膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物,送寶生物工程(大連)有限公司測序,將檢測出的3株(HXHX、BJKB、WDZY)蚊蠅樣本的PRRSV NSP2基因的核苷酸測序結(jié)果與豬源PRRSV(CH-1a 、CH-1R 、GZJS 、GZKB、GZWB、HB-2、HUN-4、HXKB 、JXA1、VR2332、YUNI)株 NSP2基因的核苷酸進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV-N基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

用Trizol法提取豬場蚊蠅樣本總 RNA,針對(duì)PRRSV-N基因,進(jìn)行 RT-PCR檢測,經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果見圖1。

從圖1可知,花溪、烏當(dāng)、畢節(jié)3個(gè)豬場蚊蠅待檢樣本均擴(kuò)增出大小約372 bp的片段,與陽性對(duì)照的片段大小一致 ,而貴陽(康寶)和六盤水2個(gè)豬場的蚊蠅樣本未擴(kuò)增出預(yù)期片段。

2.2 PRRSV-NSP2基因的克隆與序列分析

2.2.1 PRRSV-NSP2基因的RT-PCR擴(kuò)增 針對(duì)PRRSV-NSP2基因,對(duì)PRRSV-N基因檢測為陽性的蚊蠅樣本進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出,花溪、烏當(dāng)、畢節(jié)3個(gè)豬場蚊蠅待檢樣本擴(kuò)增出大小約為1 064 bp的片段,與陽性對(duì)照的片段大小一致。

2.2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 回收目的DNA片段,連接到pMD-18T載體上,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞上,經(jīng)藍(lán)白斑篩選后,提取重組質(zhì)粒 DNA,采用PRRSV-NSP2基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果均可見到特異性的DNA條帶(圖3)。以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和PsTⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后,均能見到約為1 156 bp和2640 bp的2條DNA片段(圖 4),與理論推斷的DNA片段大小基本一致。

圖1 PRRSV-N基因?qū)F州省5個(gè)豬場蚊蠅樣本的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.1 The RT-PCR results amplified by PRRSV N gene primers to the flies and mosquitoes from five farms in Guizhou

圖2 PRRSV-NSP2基因?qū)?個(gè)陽性蚊蠅樣本的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.2 The RT-PCR results amplified by P RRSV NSP2 gene primers to the three positive samples of flies and mosquitoes

圖3 PRRSV-NSP2基因重組質(zhì)粒DNA的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR amplification of PRRSV-NSP2 gene recombinant plasmid

圖4 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.4 The results of recombinant plasmid double digestion identification

2.2.3 NSP2核苷酸序列及同源性比較

應(yīng)用DNA Star軟件進(jìn)行序列比對(duì),3株貴州省蚊蠅樣本的PRRSV-NSP2基因的核苷酸測序結(jié)果之間存在較高的同源性,可達(dá)97.9%～98.3%;蚊蠅樣本的 PRRSV-NSP2基因片段與貴州豬場豬源PRRSV流行株相比具有較高的核苷酸同源性,高達(dá)97.6%～100.0%,與國內(nèi)最近流行變異毒株的核苷酸同源性為84.3%～98.8%,而與早期國內(nèi)外分離經(jīng)典毒株的核苷酸同源性為77.1%～97.7%(表1)。

表1 蚊蠅與豬場豬源PRRSV NSP2基因核苷酸序列同源性比較Table 1 Comparision of the nucleotide homology of PRRSV NSP2 between indigenous flies,mosquitoes and swine

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征是嚴(yán)重影響中國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一大疫病,嚴(yán)重?fù)p害了廣大農(nóng)民和各地區(qū)養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)效益。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的發(fā)生,除與基因變異致使病毒的毒力增強(qiáng)有關(guān)外,也與其傳播途徑密切相關(guān),如感染豬、精液、污染用具、出入車輛、空氣以及蟲媒等,均能傳播該病毒[2-3,6]。2006年6月我國南方部分地區(qū)(江西、湖北、湖南、安徽等)在高溫高濕季節(jié)突發(fā)高致病性、高死亡率的豬“高熱病”,經(jīng)多方面實(shí)驗(yàn)證實(shí)該“高熱病”主要病原為高致病性PRRSV,與經(jīng)典PRRSV株存在一定的變異。豬繁殖與呼吸綜合征多發(fā)于每年的4月～10月份,而此時(shí)間段正是蚊蠅等昆蟲孳生的最佳時(shí)期。史開志等[8]報(bào)道三帶喙庫蚊體內(nèi)也能攜帶PRRSV,因此,本研究通過調(diào)查蚊蠅體內(nèi)能否檢測到PRRSV,采用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)貴州省豬場蚊蠅PRRSV變異情況進(jìn)行了分析,進(jìn)而證實(shí)來源于豬場的蚊蠅樣本中確實(shí)攜帶PRRSV,并且與一些流行株和傳統(tǒng)株存在一定的變異性,本研究結(jié)果對(duì)該病的防控具有著重要意義。

本研究通過采集貴州省5個(gè)豬場蚊蠅樣本,通過RT-PCR方法檢測PRRSV核酸,結(jié)果顯示,3家豬場采集的蚊蠅樣本PRRSV檢測為陽性,這可能與這些豬場一直存在PRRSV的持續(xù)性感染有關(guān),蚊蠅是否能垂直傳播PRRSV,尚需進(jìn)一步研究。

由于時(shí)間、條件等原因,蚊蠅是否通過垂直傳播感染卵從而傳播PRRSV,PRRSV在蚊蠅體內(nèi)中是否導(dǎo)致突變,這些突變是否改變病毒的抗原性,以及突變后的病毒在毒力和致病力等方面是否發(fā)生改變,還需要進(jìn)一步研究。

[1]Albina E.Epidemiology of porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS):an overview[J].Vet Microbiol,1997,55:309-316.

[2]童光志,周艷君,赫曉芳,等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29(5):323-327.

[3]張建武,張金山,袁世山.中國部分地區(qū)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分子流行病學(xué)研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(6):1822-1831.

[4]吳錦艷,田 宏,尚佑軍,等.豬生殖與呼吸綜合征病毒HN/XT/07株的分離鑒定及其Nsp2基因的特性分析[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2008,38(12):1033-1037.

[5]Tian K G,Yu X L,Zhao T Z,et al.Emergence of fatal PRRSV variants:Unparalleled outbreaks of atypical P RRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLoS ONE,2007,2(6):e526.doi:10.1371/Journal Pone.0000526.

[6]Christopher H J,Nelson E A,Hines R J,et al.Persistence of porcine reproductive and respiratory sy ndrome virus in serum and semen of adult boars[J].Vet Diagn Invest,1995,7:456-464.

[7]Otake S,Dee S A,Rossow K D,et al.Transmission of porcine reproductive and respiratory sy ndrome virus by needles[J].Vet Rec,2002,150:114-115.

[8]史開志,毛君婷,王開功,等.三帶喙庫蚊攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒的初步證實(shí)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,40(2):280-28.

[9]史開志,文 明,周碧君,等.三帶喙庫蚊體內(nèi)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離與鑒定[J].昆蟲學(xué)報(bào),2009,52(5):509-513.

[10]郭寶清,陳章水,劉文興,等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國畜禽傳染病,1996,7(2):1-4.

[11]席光勝,吳其彪,百 花,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及流行病學(xué)調(diào)查[J].中國畜牧獸醫(yī),2009,36(6):165-168.

[12]朱良強(qiáng),王 非,占松鶴,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒安徽株的分離與鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī),2009,36(12):115-119.

[13]唐文山.青海省農(nóng)區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征血清流行病學(xué)調(diào)查[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(10):69-73.

[14]王 非,占松鶴,劉 華,等.安徽省部分規(guī)?；i場豬繁殖與呼吸綜合征血清學(xué)調(diào)查[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(12):113-115.

[15]鄭文成,郭永祥,劉道新,等.豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫研究概況[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(10):100-102.

[16]魏衍全,田 宏,吳錦艷,等.豬繁殖與呼吸綜合征檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志,2011,31(4):124-128.

[17]臧瑩安,蔣天宇,楊展基,等.廣東部分地區(qū)豬場PRRS的血清學(xué)調(diào)查[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,31(4):124-127.

Investigation on Mosquitoes and Flies Carrying PRRSV in Five Pig Farms of Guizhou

LU Xian-li1,ZHOU Bi-jun1,2,WANG Kai-gong1,2,WEN Ming1,2,CHENG Zhen-tao1,2,LUO Yi1,JIANG Nan1

(Guizhou University,College of Animal Science,Guiyang,Guizhou,550025,China;
2.Laboratory of Animal Disease in Guizhou Province,Guiyang,Guizhou,550025,China)

In order to detect porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)in mosquitoes and flies,the mosquitoes and flies in five pig farms of Guizhu were selected.RT-PCRwas used to clone the PRRSV NSP2 gene,and the sequsences was analyzed.The resultes indicated that the length of the PRRSV N gene fragment in the mosquitoes and flies is 372 bp in three pig farms named Huaxi,Wudang,Bijie.The homology of PRRSV NSP2 gene in the three samples of mosquito and flies is up to 97.9%-98.3%,the homology of PRRSV NSP2 gene segments between samples and Guizhou swine PRRSV strains is up to 97.6%-100.0%,the homology between samples and recently popular variant strains of domestic is up to 84.3%-98.8%,the homology between samples and classical strains isolated is up to 77.1%-97.7%.Experimental results showed that mosquitoes and flies collected from some pig farms in Guizhou carried porcine reproductive and respiratory syndrome virus.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus;mosquitos;fliy;cloning and sequence analysis

S852.659.6

A

1007-5038(2011)09-0030-04

2011-06-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31072158);貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合 NY字(2009)3071號(hào)];貴州省農(nóng)業(yè)委員會(huì)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010-11)

路憲禮(1984-),男,河南商丘人,碩士研究生,主要從事獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)研究。